范光森,劉朋肖,吳秋華,富志磊,朱宇婷,成柳潔,李秀婷,*

(1.北京工商大學,北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048;2.北京工商大學,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048;3.北京工商大學食品學院,北京 100048)

白酒是我國國酒,其雖非是人民生活必需品,但卻在我國人民日常生活中扮演著重要的角色[1]。乙醇是白酒的主體成分,乙醇體積分數(shù)不僅是評價白酒品質(zhì)的重要質(zhì)量指標,關(guān)系到酒的香氣、口味和風格,而且也會影響到白酒的產(chǎn)量[2]。眾所周知,白酒生產(chǎn)過程中影響其乙醇含量的因素有很多,包括原料、釀造工藝、微生物菌群、蒸餾等,在這些眾多因素中,微生物的生命活動無疑是最為關(guān)鍵的因素。在酒精飲料中,酵母菌無疑是負責生產(chǎn)乙醇的重要菌群,尤其是釀酒酵母,是白酒整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株,擔負著乙醇發(fā)酵的重要作用,對于白酒發(fā)酵速率、風味及品質(zhì)具有重要的貢獻[3]。

雖然,我國白酒生產(chǎn)仍沿襲傳統(tǒng)釀造工藝手段,但隨著我國白酒走向國際化,其傳統(tǒng)釀造過程中暴露的不足勢必會推動我國白酒釀造的革新,在傳承的基礎上,逐步走向白酒釀造的現(xiàn)代化式生產(chǎn),由現(xiàn)今粗放型的釀造向智能化標準型釀造轉(zhuǎn)型。在這一過程中,嘗試新的釀造方式有利于白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展如不銹鋼槽車地面恒溫發(fā)酵系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)地缸發(fā)酵,發(fā)酵桶、發(fā)酵池代替?zhèn)鹘y(tǒng)發(fā)酵設備陶缸或窖池[4]。在這種由地下轉(zhuǎn)為地上的釀造方式轉(zhuǎn)變過程中,白酒釀造環(huán)境也發(fā)生了微妙的變化,其中較為突出的便是釀酒過程中氧氣含量的變化,由原來較為嚴格的厭氧環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒀趸蛴醒醐h(huán)境,這種變化勢必要求釀造所用微生物特性也隨之改變[5-6]。選育獲得在有氧條件下高產(chǎn)乙醇的酵母,并對其進行相關(guān)生物學特性的研究,有目的地將其應用于白酒實際生產(chǎn)中,對改善我國白酒生產(chǎn)工藝,促進中國白酒的發(fā)展具有重大的現(xiàn)實意義[7]。然而,有關(guān)研究工作相對欠缺,已有的研究主要集中于酵母利用非葡萄糖碳水化合物轉(zhuǎn)化產(chǎn)乙醇。為此,本文通過傳統(tǒng)篩選方法旨在獲得一株適應有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇的酵母,為未來白酒生產(chǎn)方式變革提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清香型大曲 取自河北衡水老白干釀酒集團2017年12月制備的大曲,粉碎后按照四分法取樣于4 ℃保存?zhèn)溆?乙醇標準品 購自Sigma公司;真菌基因組DNA提取試劑盒 購自北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等試劑 均為國產(chǎn)生物或分析純試劑;YPD培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂粉20,115 ℃滅菌20 min;乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖200,酵母浸粉10,蛋白胨20,硫酸銨1,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂1,蒸餾水定容,115 ℃滅菌20 min。

YQX-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;BCN-1360型生物潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;電子天平、pH計 賽多利斯科學儀器有限公司;LHS-100CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器設備有限公司;TU-19紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;CKX41-F32FL倒置熒光顯微鏡 日本OLYMPUS;Tprofessional PCR儀 Biometra公司;Microfuge 2R離心機 北京田林恒泰科技有限公司;1260series高效液相色譜儀 Agilent科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌株的篩選和分離 采用YPD培養(yǎng)基進行白酒大曲中酵母菌的篩選和分離,方法參照許岱等[8]的方法。用無菌水將酒曲曲粉制成菌懸液后,逐級稀釋不同濃度梯度的菌懸液,取不同梯度菌懸液100 μL涂布于YPD平板上,30 ℃倒置培養(yǎng),挑取單菌落劃線分離后進行顯微鏡觀察,確定其為純菌株。

1.2.2 有氧條件下產(chǎn)乙醇酵母菌株篩選 將1.2.1中所篩選得到的酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃,轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床中活化培養(yǎng)24 h,按1%接種量接入乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃,轉(zhuǎn)速為90 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液于室溫條件下,10000 r/min離心10 min,獲得的上清液采用高效液相色譜法檢測乙醇含量。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)觀察 將1.2.2初篩獲得的高產(chǎn)乙醇菌株接種至YPD培養(yǎng)基上,30 ℃下培養(yǎng)2 d后進行觀察;挑取YPD平板上單菌落少量菌體,涂布并固定在載玻片上,進行美藍染色液染色,制作臨時裝片,置于熒光倒置顯微鏡載物臺上,采用油鏡(×1000)觀察,記錄細胞形態(tài)特征、出芽情況。

1.2.3.2 生理生化分析 菌株生理生化分析參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》,包括糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、淀粉水解試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、尿素試驗、硫化氫試驗、牛奶石蕊試驗、V.P.試驗、明膠水解試驗和檸檬酸鹽試驗[9]。

1.2.3.3 分子生物學鑒定 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取1.2.2初篩獲得的高產(chǎn)乙醇酵母基因組DNA,參考許岱等[8]的PCR擴增條件,采用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴增26S rDNA D1/D2區(qū)序列。將驗證后的PCR擴增產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行BLAST同源性比對,使用MEGA 6.0生物學軟件進行多序列比對分析,利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株生物學特性研究 酵母菌株生物學特性研究包括NaCl耐受性(0%、5%、10%、15%、20%、25%和30%,w/v)、乙醇耐受性(0%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%和20%,v/v)、葡萄糖耐受性(10%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%,w/v)、乙酸耐受性(0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%和2.0%,v/v)、生長溫度范圍(20、25、30、35、40、45、50、55和60 ℃)和pH范圍(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)。具體操作方法參照文獻[10]。

1.2.5 高效液相色譜法測定乙醇含量 發(fā)酵液離心后上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾,進行高效液相色譜檢測乙醇。具體方法參照Sun等[11]:BioRad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm);0.01 mol/L H2SO4,流速:0.5 mL/min;柱溫25℃,進樣量20 μL,外標法定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進行三個平行,數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示,利用Excel 2016和Origin 9.0繪圖軟件處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)乙醇酵母菌篩選結(jié)果

通過梯度稀釋結(jié)合平板涂布方法先后從老白干大曲中分離出60株菌株,經(jīng)菌落形態(tài)觀察,初步確定這些菌株為酵母菌。將上述酵母菌分別接種到乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,并對其發(fā)酵液中乙醇含量進行測定,試驗結(jié)果見表1。有24株酵母能夠在搖動條件下,即有氧環(huán)境下發(fā)酵產(chǎn)乙醇,并且乙醇產(chǎn)量基本都在10.0 g/L以上,其中酵母YF1914和YF1703發(fā)酵液中乙醇含量超過50.0 g/L,尤其是YF1914為這些酵母中乙醇產(chǎn)量最高菌株,其乙醇含量達到60.1 g/L,為此將其確定為本研究的目標菌株。

表1 不同酵母發(fā)酵液中乙醇含量比較結(jié)果Table 1 Comparison of alcohol production after fermentation by different yeasts

2.2 酵母YF1914的鑒定結(jié)果

2.2.1 酵母YF1914形態(tài)特征 菌株YF1914在YPD鑒定平板上的生長特征如圖1a所示,菌落呈白色,表面光滑,突起,邊緣規(guī)則,內(nèi)部濕潤易挑起;顯微鏡下細胞形態(tài)特征如圖1b所示,細胞為卵圓形或紡錘型,一端出芽(圖1b中圈標記處),無菌絲體,屬典型酵母特征。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)初步確定菌株YF1914為酵母菌。

圖1 酵母YF1914在YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征(a)及顯微鏡下細胞形態(tài)特征(10×100)(b)Fig.1 Colony morphology(a)of yeast strain YF1914 on YPD culture medium and cell morphology(b)of yeast strain YF1914 captured by microscope(10×100)注:b中圈出酵母處于出芽狀態(tài)。

2.2.2 酵母YF1914生理生化結(jié)果 從表2可以看出,酵母YF1914能利用葡萄糖、半乳糖、麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣,利用蔗糖發(fā)酵只產(chǎn)氣不產(chǎn)酸,利用纖維二糖發(fā)酵只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,而不能利用乳糖、可溶性淀粉、木糖和阿拉伯糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣。該酵母能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、檸檬酸、乙醇、海藻糖等碳源生長,而不能利用山梨醇、甘露醇、山梨糖、鼠李糖進行生長。氮源同化試驗結(jié)果表明,該酵母能利用尿素、硫酸銨、硝酸鉀和L-苯丙氨酸作為唯一氮源進行生長,而不能利用亞硝酸鉀作為氮源進行生長。除了吲哚試驗和尿素試驗為陽性反應外,淀粉水解試驗、甲基紅試驗、V.P.試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠水解試驗和牛奶石蕊試驗等都為陰性反應。根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9],該酵母菌與釀酒酵母屬(Saccharomycescerevisiae)的生理特性相似度最高,初步認為該菌屬屬于釀酒酵母屬。

表2 酵母YF1914生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of yeast strain YF1914

2.2.3 酵母YF1914分子生物學鑒定結(jié)果 通過真菌基因組DNA提取試劑盒提取分離酵母YF1914基因組DNA,并以其為模板成功擴增獲得該酵母的26S rDNA基因條帶(圖2),將酵母YF1914的26S rDNA產(chǎn)物進行測序,測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對,結(jié)果表明,該菌與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的26S rDNA序列同源性最高,相似度達到99%。利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining方法對該菌株及與其序列相似度較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。由圖3可以看出該酵母與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)KP070744.1的親緣關(guān)系最近。綜合以上試驗結(jié)果,菌株YF1914被鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis 注:M:DL2000 DNA Marker;1:YF1914總DNA;2:YF1914擴增26S rDNA D1/D2序列。

圖3 酵母YF1914基于26S rDNA D1/D2序列及Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain YF1914 using neighbor-joining analysis based on the 26S rDNA D1/D2

2.3 酵母YF1914生物學特性分析

2.3.1 NaCl耐受性 滲透壓能夠引起細胞內(nèi)水分活度、細胞結(jié)構(gòu)及組成成分的變化,甚至會破壞細胞膜上或胞內(nèi)的酶活,從而影響微生物的生長。不同種類的微生物由于生長所處的外界環(huán)境不同,通過環(huán)境壓力的選擇而產(chǎn)生了適應不同滲透壓的微生物菌群[10]。白酒釀造環(huán)境比較復雜,因此會產(chǎn)生不同適應能力的微生物。由圖4可以看出酵母YF1914具有一定的耐鹽性,隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加(0～15%),酵母生長速率雖然受到的抑制程度加強,但當NaCl質(zhì)量分數(shù)為15%時,酵母YF1914仍然能夠生長,培養(yǎng)24 h,OD560為0.35,當NaCl質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加至20%時,其生長停滯(圖4)。一般而言,NaCl質(zhì)量分數(shù)大于15%時,會抑制大多數(shù)微生物的生長繁殖[12]。韋元琪等[13]利用鹽濃度梯度富集培養(yǎng)從洋河酒曲中篩選獲得了1株在1.4 mol/L NaCl濃度下生長的庫德里阿茲威氏畢赤酵母,該酵母在高鹽條件下生長時,其胞內(nèi)海藻糖的積累顯著增加;付肖蒙等[14]為提高醬油生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì),篩選獲得了多株在添加了6%質(zhì)量分數(shù)NaCl的培養(yǎng)基中能很好生長的酵母;本研究課題組在前期從酒曲中也獲得多株高耐受NaCl酵母菌株,其中酵母Y1401最高NaCl耐受質(zhì)量分數(shù)高達20%[10]。這些高耐受NaCl酵母可能是由于白酒釀造過程中的復雜環(huán)境造成的,有利于其快速適應白酒釀造環(huán)境。

圖4 酵母YF1914的NaCl耐受性Fig.4 NaCl tolerance of the strain YF1914

2.3.2 乙醇耐受性 酵母耐乙醇能力在一定程度上決定了其產(chǎn)乙醇能力,也決定了其在白酒釀造中的應用。由圖5可以看出,酵母YF1914在不同濃度乙醇的生長規(guī)律與在不同NaCl濃度條件下的情況類似,隨著濃度的增加,生長速率逐漸下降,即乙醇對酵母產(chǎn)生了一定的毒害作用。值得注意的是,該酵母即使在乙醇濃度為18%時仍能生長(生長24 h,OD560為0.30)。按照酵母乙醇耐受性劃分標準,其屬于乙醇高耐受性酵母[15],該酵母這一特點有利于其在白酒釀造中的應用。姚淑敏等[16]從甜酒釀中篩選獲得一株乙醇耐受濃度為16%的東方伊薩酵母;滕超等[17]從老面團中分離到兩株酵母Q3505和Q5503,這兩株酵母都具有高乙醇耐受性,耐受能力分別為14%和16%。研究表明,酵母的細胞壁和細胞膜的構(gòu)成會影響酵母乙醇耐受性[18],推測白酒復雜的釀造環(huán)境可能會引起酵母細胞壁和細胞膜構(gòu)成發(fā)生改變,從而適應復雜的釀造環(huán)境。

圖5 酵母YF1914的乙醇耐受性Fig.5 Ethanol tolerance of the strain YF1914

2.3.3 葡萄糖耐受性 酵母菌大多數(shù)能夠適應高糖的環(huán)境,并且,在釀酒過程中發(fā)酵的基礎物質(zhì)是糖,具有高糖耐受性的酵母有利于釀造發(fā)酵產(chǎn)乙醇。由圖6可以看出,在較低葡萄糖濃度條件下培養(yǎng)時,葡萄糖主要作為碳源提供酵母充足的營養(yǎng)物質(zhì),促進酵母的生長,但隨著濃度的增加,高濃度的葡萄糖形成的高滲透壓對酵母細胞產(chǎn)生抑制作用,從而導致其生長速率下降,這與張莉等[19]研究結(jié)果一致。另外,可以發(fā)現(xiàn)該酵母在葡萄糖濃度為80%時仍能夠生長,具有較高的葡萄糖耐受性,該酵母這一特征從發(fā)酵底物耐受性角度進一步表明,其在白酒釀造中具有潛在的提高白酒產(chǎn)率的應用價值。

圖6 酵母YF1914的葡萄糖耐受性Fig.6 Glucose tolerance of the strain YF1914

2.3.4 乙酸耐受性 在白酒釀造發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中會伴隨產(chǎn)生很多種風味物質(zhì),其中短鏈有機酸物質(zhì)在這一過程中會大量積累,尤其是乙酸,不僅因其是白酒重要風味物質(zhì)的前體物質(zhì),也因其會影響白酒釀造過程中微生物菌群的改變,從而影響到白酒的品質(zhì)。圖7表明,酵母YF1914具有一定的乙酸耐受性,在乙酸濃度為0.5%時能夠較好的生長,但超過0.75%時該酵母不能夠生長,這與付肖蒙等[14]篩選得到的酵母乙酸耐受能力較為接近。該酵母這一特性能在一定程度上轉(zhuǎn)化白酒釀造環(huán)境中產(chǎn)生的乙酸形成乙酸乙酯等白酒重要風味物質(zhì),不僅提高白酒釀造高產(chǎn)乙醇,而且還具有增香特性。

圖7 酵母YF1914的乙酸耐受性Fig.7 Acetic acid tolerance of the strain YF1914

2.3.5 生長溫度 在白酒釀造過程中,溫度存在較大的變化范圍,如果酵母能夠很好的適應寬廣的溫度范圍,那么勢必將會在白酒釀造整個過程中發(fā)揮更大的作用。研究結(jié)果表明,該菌能夠在較寬廣的溫度范圍內(nèi)生長(20～50 ℃),并且其最適生長溫度為25～35 ℃(圖8)。這一結(jié)果表明酵母YF1914能夠很好的適應白酒釀造過程中溫度的變化,在白酒釀造中具有較好的應用價值。耐高溫釀酒酵母因能更好的適應白酒釀造實際環(huán)境,同時可以通過輔加一定真空條件實現(xiàn)乙醇邊發(fā)酵邊揮發(fā)的持續(xù)釀造,降低生成能耗等優(yōu)勢,得到了越來越廣泛地關(guān)注[20]。酵母YF1914生長溫度范圍比較寬廣可能是在白酒釀造過程中自然篩選的結(jié)果。

圖8 酵母YF1914在不同溫度下生長情況Fig.8 The growth of strain YF1914 at different temperature

2.3.6 生長pH 在白酒發(fā)酵過程中,酵母菌和環(huán)境生態(tài)因子之間地相互作用導致酸性物質(zhì)逐漸產(chǎn)生和積累,從而導致發(fā)酵環(huán)境pH下降,進而影響到酵母菌的生理代謝。因此,酵母菌對環(huán)境pH變化地適應能力是決定其發(fā)酵過程中原料利用和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[21]。從圖9的實驗結(jié)果可見,該酵母能夠在pH1～10范圍內(nèi)生長,并且最適生長pH為5～6,由此可見該酵母能夠很好的適應白酒釀造過程中pH的變化。

圖9 酵母YF1914在不同pH下生長情況Fig.9 Growth of strain YF1914 at different pH

3 結(jié)論

本研究從老白干香型大曲中篩選獲得一株在有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇的酵母,通過形態(tài)觀察、生理生化分析和分子生物學檢測綜合結(jié)果鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。該酵母具有良好的乙醇耐受性、NaCl耐受性和葡萄糖耐受性以及寬廣的溫度和pH適應性。綜上可見,該酵母適合應用于白酒釀造過程中,并且可以作為功能強化菌調(diào)控白酒的風味。