馬燕 黃海珠 金樁 易永紅 陳俊波 謝式云

摘要：該研究將分離篩選所得的酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌復配得到紅茶菌，以綠茶基液為發(fā)酵液，對紅茶菌中3株菌接種量、配比、時間、溫度、加糖量和裝液量培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結合pH值、菌膜生成情況及菌液總活菌數(shù)，得出最佳接種比例分別為酵母菌1%、產(chǎn)膜醋酸菌3%、乳酸菌1%，即總接種量5%，最適培養(yǎng)溫度為30°C，最佳培養(yǎng)時間為8d，綠茶基液最適加糖量8%，裝液量60%。

關鍵詞：紅茶菌;優(yōu)化;pH值;菌膜;總活菌數(shù)

中圖分類號：TS275

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.001

0引言

紅茶菌是以茶葉、糖和水為發(fā)酵基液，由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多種有益微生物所組成的共生體共同發(fā)酵而成[1-2]。紅茶菌雖在我國民間流傳已久，但對紅茶菌菌種及其相互作用方面的基礎研究還不夠系統(tǒng)[3]，在紅茶菌菌種培養(yǎng)過程中，由于紅茶菌來源不同，篩選純化的單一菌種復合配伍后的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基液成分構成等都有待進一步探討[4-6]。本研究主要將分離篩選得到酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌進行復配培養(yǎng)得到共生體，通過將綠茶液中的培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到優(yōu)質的紅茶菌，為下一步生產(chǎn)中草藥紅茶菌制劑提供紅茶菌母種，并用于豬場防控疫病及提高不同豬群的生產(chǎn)性能。

1材料與方法

1.1菌種來源

由羅牛山股份有限公司博士后科研工作站實驗室，從不同來源（山東威海及廣東湛江）購買的紅茶菌產(chǎn)品中分離篩選得到的優(yōu)勢微生物酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌作為試驗菌種。

1.2儀器設備

生化培養(yǎng)箱（LRH-150上海一恒科學儀器有限公司）;pH計（FE28梅特勒一多利儀器（上海）有限公司）;3M菌落總數(shù)測試片（6406明尼蘇達礦業(yè)制造（上海）國際貿(mào)易有限公司）;電熱鼓風干燥箱（101A-2B型上海實驗儀器有限公司）;生物潔凈工作臺（SA-960-2型，上海上凈凈化設備有限公司）;電子天平（BL6100北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.3測定方法

pH值測定：采用PH酸度計直接測定;

總活菌數(shù)測定：采用3M試紙計數(shù);

菌膜：觀察膜光滑程度，采用游標卡尺測量菌膜厚度。

1.4菌種培養(yǎng)

酵母菌培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母菌提取物10g，蛋白胨20g，硫酸鎂0.5g和磷酸二氫鉀0.3g，瓊脂20g，1L蒸餾水。加熱使所有成分溶解，冷卻后用6mol/L的H°CL將pH值調至4.2，分裝，121°C濕熱滅菌20min，斜面接種，30°C培養(yǎng)24h，置冰箱中保藏備用。擴大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基（上述培養(yǎng)基不加瓊脂），接種30°C培養(yǎng)41h，酵母菌數(shù)量在108°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏備用。

產(chǎn)膜醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母浸膏3g，蛋白胨2g，碳酸鈣10g，瓊脂20g，pH值6.8，蒸餾水1000mL，劃平板接種，30°C培養(yǎng)3d，置冰箱冷藏備用。擴大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基（上述培養(yǎng)基不加碳酸鈣和瓊脂），滅菌后冷卻至50°C左右加入無水乙醇2%，接種30°C培養(yǎng)7d，其培養(yǎng)菌液pH值達到3.0以下，總活菌數(shù)達到104°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏備用。

短桿乳酸菌培養(yǎng)基[7]：蛋白胨12g，酵母提取物5g，牛肉膏12g，葡萄糖16g，乙酸鈉5g，檸檬酸胺2.15g，吐溫80mL，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.03g，磷酸氫二鉀2g，瓊脂17g，水1000mL，pH值5.5。擺斜面接種，溫度為35°C培養(yǎng)24h，置冰箱冷藏備用。擴大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)（上述培養(yǎng)基不加瓊脂），培養(yǎng)條件相同，分光光度計測定其菌液OD值增加0.9以上，菌數(shù)達到1010cfu/mL以上，冰箱保藏備用。

1.5培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗

培養(yǎng)條件優(yōu)化：制備綠茶發(fā)酵基液正交篩選紅茶菌三株菌最適復配比優(yōu)化培養(yǎng)紅茶菌時間、溫度、加糖量和裝液量等條件。

1.6試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用WPS電子表格對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖表處理。

2結果與分析

2.1制備綠茶發(fā)酵基液

綠茶液發(fā)酵基液制備：蔗糖（白砂糖）5%，綠茶和水比例為1：150，將水煮沸，在100°C水中加入蔗糖及茶葉煮沸5min再浸提20min，過濾茶渣，自然pH值，按40%的裝液量分裝備用[8-10]。

2.2篩選紅茶菌各菌種接種量最適復合配比

試驗采用L9（34）正交試驗，以紅茶菌產(chǎn)品中分離篩選得到的3株菌（按酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌、短桿乳酸菌順序）液體活化菌種為3個因素，分別按1%、2%、3%為3個水平接種量組合接種到綠茶液培養(yǎng)基中，在溫度為30°C條件下靜置培養(yǎng)10d，通過pH降低變化值（△pH值）篩選最適紅茶菌各菌種接種量復合配比組合。試驗設計見表1，結果見表2。

紅茶菌各菌種接種量實際最優(yōu)復合配比組合為AIB3C3即酵母菌1%，產(chǎn)膜醋酸菌3%，短桿乳酸菌3%，10dpH值降低2.69。但經(jīng)分析得出理論最優(yōu)組合為AjB3C，與實際操作組合不一致，通過驗證試驗結果表明：理論組合A.B3C10d△pH值為2.91，比實際組合pH值多下降0.22。趙文紅4等通過正交試驗研究菌種比例對綠茶發(fā)酵液品質的影響，接人酵母菌、醋酸菌和乳酸菌量最優(yōu)組合為3%、1%、3%。左勇中等將分離篩選得到的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌進行配比得到紅茶菌復合菌種，結果表明，乳酸菌、醋酸菌、酵母菌按質量配比2：2：1，即總接種量5%，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中發(fā)酵效果最好。馬騁[5]等采用自行分離純化的酵母菌Y1、乳酸菌R3、醋酸菌C5進行純種混合發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌飲料，結果表明，酵母菌：醋酸菌：乳酸菌的比例是1：1：2，接種量為5%紅茶菌的發(fā)酵效果最好。紅茶菌單一菌種復合配比雖各不同，但總接種量均為5%左右，本研究根據(jù)正交驗證試驗結果選用紅茶菌單一菌種接種量最適復合配比為酵母菌1%，產(chǎn)膜醋酸菌3%，短桿乳酸菌1%，可見與上述研究均不同，這可能是菌株種類及菌種來源不同而有所差異的原因，但總接種量亦為5%，由正交試驗結果顯示，產(chǎn)膜醋酸菌對紅茶菌生長影響最大，其次是酵母菌，而短桿乳酸菌影響最小。見表2。

2.3優(yōu)化紅茶菌復合菌種各培養(yǎng)條件

2.3.1培養(yǎng)時間

按最佳接種量組合接種至綠茶液培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)，0、2、4、6、8、10、12d分別觀察菌膜情況及取樣測定pH值、總活菌數(shù)，以確定紅茶菌最佳培養(yǎng)時間，見表3。

隨著時間的延長，紅茶菌在培養(yǎng)初期1～6d，pH值明顯降低，培養(yǎng)6d后菌液表面形成成片菌膜;培養(yǎng)6～8dpH值趨于穩(wěn)定，菌膜厚度逐漸增厚變光滑，第8d菌數(shù)達到峰值;8d后pH值變化不大，有新的菌膜生成但厚度增加不明顯，菌液活菌數(shù)逐漸減少。廖盧燕等以研究紅茶菌發(fā)酵液與菌膜中主要微生物的數(shù)量變化結果表明，通常紅茶菌菌液中的醋酸菌和酵母菌數(shù)量都要比紅茶菌菌膜中的數(shù)量多，培養(yǎng)初期酵母菌和醋酸菌的數(shù)量基本上都呈上升的趨勢，發(fā)酵6～8d后數(shù)量不斷慢慢下降。因此本實驗選擇紅茶菌最佳培養(yǎng)時間為8d。見圖1。

2.3.2培養(yǎng)溫度

按最佳接種量組合接種紅茶菌至綠茶液培養(yǎng)基中，分別在25、28、30、33、36°C溫度條件下，培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況及取樣測定pH值、活菌數(shù)，以確定最佳培養(yǎng)溫度，見表4。

培養(yǎng)溫度為28°C時，總活菌數(shù)最多，pH值也相對較低，但其菌膜并未成片生成，分析其原因是酵母菌和乳酸菌在培養(yǎng)前期生長均比較旺盛，菌液活菌數(shù)增多，而其中乳酸菌的大量繁殖使pH值降低，在一定程度上又抑制產(chǎn)膜醋酸菌生長，導致菌膜生成速度變慢;在30°C溫度條件下培養(yǎng)，菌膜表面光滑厚度可達3.73mm，pH最低為2.74，總活菌數(shù)略少于28°C培養(yǎng)，說明在此溫度下酵母菌大量繁殖其代謝產(chǎn)物促進了產(chǎn)膜醋酸菌生長，菌膜大量形成，將菌液中的部分活菌包埋及菌體自身形成菌膜導致菌液中的總菌數(shù)減少，隨著菌膜厚度增厚，菌液環(huán)境更適合兼性厭氧菌短桿乳酸菌生長，菌液pH值降低明顯;33°C和36°C2個溫度條件下，紅茶菌也可以生長，但通過觀察測定菌膜、pH值及總活菌數(shù)3個指標比較均不如30°C培養(yǎng)好。綜合3個測定指標，為了更有利于紅茶菌互生互利生長，篩選紅茶菌最佳的培養(yǎng)溫度為30°C。見表4。

2.3.3加糖量

分別添加蔗糖（白砂糖）量為0%、2%、4%、8%、10%、12%配制綠茶液培養(yǎng)基，自然pH值，按40%裝液量分裝后接種最佳接種量組合菌種，溫度30°C條件下培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況、pH值降低變化值（△pH值）及總活菌數(shù)，以確定最佳加糖量。見表5。

白砂糖的添加量小于10%時，隨著加糖量不斷增多，紅茶菌復合菌菌液的pH值降低變化比較明顯，當加糖量為8%時，菌膜表面光滑厚度達1.58mm，pH值降低變化值達到峰值，總活菌數(shù)最多。進一步增大加糖量達10%～12%，菌膜生成情況變差，其pH值降低程度與8%相差不大，總活菌數(shù)均低于8%的加糖量。試驗結果說明蔗糖（白砂糖）添.加量適宜可以促進紅茶菌生長繁殖，添加量過低則菌體不長或繁殖緩慢，過高反而會抑制生長，因此確定綠茶液中最適加糖量為8%。見表5。

2.3.4裝液量的影響

在250mL三角瓶中分別裝人綠茶液培養(yǎng)基的量為20%、40%、60%、80%，按最佳接種量組合接種至加糖量為8%的綠茶液培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況、pH值降低變化值（△pH值）及菌數(shù)，以確定最佳裝液量。見表6。

按不同裝液量在250mL三角瓶中裝入綠茶培養(yǎng)基培養(yǎng)紅茶菌，當裝液量為60%時，其菌膜表面光滑且厚度最厚，pH值的降低幅度最大，菌液中的總活菌數(shù)也最多，生長狀況最佳，而裝液量過少或者過多都影響菌膜生成及菌體生長。童婕好[11]等對夏秋茶發(fā)酵紅茶菌的初步探究結果表明，以容量600mL計算，控制每瓶裝液量為400mL，菌種平緩地進行發(fā)酵作用，可控性較高，因此在66.67%裝液量條件下，最為適宜。喬宏萍[2]等研究不同發(fā)酵體積對紅茶菌酸度、菌膜以及口味的影響結果發(fā)現(xiàn)，150mL鹽水瓶中裝不同體積的茶糖水進行發(fā)酵，在裝液量為75mL時（即裝液量50%），無論從酸度還是口感都不錯，各項發(fā)酵指標達到平衡，酸度和口味達到最佳。但是發(fā)酵體積越小，也就是瓶中的空氣量越多，菌膜越厚，發(fā)酵體積越大，菌膜越少，發(fā)酵時間越長。左勇[1等研究裝液量對紅茶菌發(fā)酵的影響結果表明，當裝液量為40%時，菌體生長狀況最佳，而裝液量過多或過少，都不利于菌體生長?？赡苁且驗檠b液量過少時，營養(yǎng)物含量低，不利于菌種的生長和酶的合成;裝液量過多，環(huán)境含氧量低，不利于氧氣的供給，也不利于菌體的生長繁殖和代謝。本研究最佳裝液量為60%，在上述研究范圍內(nèi)。

3結論

（1）通過本研究所得結果分析，紅茶菌復合菌種最佳接種酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和乳酸菌的量分別為1%、3%、1%，即總接種量5%。

（2）優(yōu)化紅茶菌復合菌種在綠茶液中培養(yǎng)的最適條件：培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間8d，最適加糖量為8%，裝液量60%。

參考文獻

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