王妍琦 肖帥 孫海鵬 王春鵬 王其新

[摘要]目的探討尿酸對原代培養(yǎng)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞（CFs）膠原合成及炎性分泌的影響，以及micro-RNA-155（miR-155）在其中的作用。方法分離培養(yǎng)乳鼠CFs，并用不同濃度（0、200、400、600、800 μmol/L）的尿酸處理。采用MTT法檢測CFs的增殖情況，羥脯氨酸試劑盒檢測膠原含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測炎性因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)水平。將miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染入CFs，選擇前述實驗結(jié)果較為穩(wěn)定的600 μmol/L尿酸刺激CFs 24 h，采用熒光定量PCR檢測miR-155、IL-6、IL-1β、TNF-α、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）的表達(dá)水平。結(jié)果與0 μmol/L尿酸組相比較，400、600、800 μmol/L尿酸組CFs的增殖和膠原含量增加（F=18.46、11.82，P<0.05），200、400、600、800 μmol/L尿酸組CFs IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)增加（F=29.32～69.76，P<0.05）。miR-155 inhibitor可明顯抑制尿酸誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β、TNF-α、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達(dá)增加（F=72.74～275.32，P<0.05）。結(jié)論尿酸可以通過miR-155促進(jìn)CFs的膠原合成及炎性分泌。

[關(guān)鍵詞]尿酸;心肌;成纖維細(xì)胞;微RNAs;膠原;炎癥

[中圖分類號]R542.33[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0290-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of uric acid on collagen synthesis and inflammatory secretion in primary cultured neonatal rat cardiac fibroblasts （CFs） and the role of microRNA-155 （miR-155） in the process. MethodsThe CFs of neonatal rats were isolated and treated with different concentrations of uric acid （0， 200，400，600， and 800 μmol/L）. The proliferation of CFs was evaluated by MTT assay， the collagen content was determined by hydroxyproline assay kit， and the expression of inflammatory factors interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The CFs were then transfected with miR-155 inhibitor and stimulated with 600 μmol/L uric acid， which yielded stable results in the above test， for 24 h. The expression of miR-155， IL-6， IL-1β， TNF-α， collagen type Ⅰ （Col-Ⅰ）， and collagen type Ⅲ （Col-Ⅲ） was determined by quantitative real-time PCR. ResultsCompared with the group treated with 0 μmol/L uric acid， the groups treated with 400， 600， and 800 μmol/L uric acid had significantly increased proliferation and collagen content of CFs （F=18.46 and 11.82，P<0.05）， and the groups treated with 200， 400， 600， and 800 μmol/L uric acid had significantly increased expression of IL-6， IL-1β， and TNF-α in CFs （F=29.32-69.76，P<0.05）. However， the increased expression of IL-6， IL-1β， TNF-α， Col-Ⅰ， and Col-Ⅲ induced by uric acid was significantly inhibited by miR-155 inhibitor （F=72.74-275.32，P<0.05）. ConclusionUric acid acts through miR-155 to promote collagen synthesis and inflammatory secretion of CFs.

[KEY WORDS]uric acid; myocardium; fibroblasts; microRNAs; collagen; inflammation

心力衰竭（簡稱心衰）是眾多心血管疾病的最終歸宿，心臟重塑和炎癥是心衰發(fā)展過程中的關(guān)鍵病理標(biāo)志。心肌纖維化是心臟重塑的關(guān)鍵原因，也是多種心臟疾病發(fā)展至一定階段的常見病理改變[1]。心肌成纖維細(xì)胞（CFs）是心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）平衡。當(dāng)心臟受損時（缺血、低氧、物理化學(xué)刺激等），CFs增殖活化，分泌炎性細(xì)胞因子，合成膠原增多，這是心肌纖維化的主要病理途徑[2]。大量流行病學(xué)研究表明，高尿酸血癥是多種心血管疾病的獨立危險因素[3-7]，血尿酸水平升高可以增加病人心衰及不良預(yù)后的風(fēng)險，且與心室重構(gòu)有著密切關(guān)系[8-9]。近年來，尿酸對心血管疾病影響的基礎(chǔ)研究主要集中在心肌細(xì)胞的損傷上[10-11]，而關(guān)于尿酸對心肌纖維化和CFs影響的研究報道相對較少。MicroRNA-155（miR-155）已被證明可以在多種心血管疾病中發(fā)揮作用[12-15]。最近的研究表明，miR-155能夠增加心肌重構(gòu)過程中蛋白的過度沉積[12，16]，但是miR-155在CFs炎癥反應(yīng)中的作用研究相對較少。本研究應(yīng)用尿酸刺激CFs，觀察其對細(xì)胞炎性分泌及膠原合成的影響，并探討miR-155在其中的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物出生2～3 d的Wistar大鼠，雌雄不限，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.1.2試劑尿酸（Sigma公司），DMEM培養(yǎng)液、2.5 g/L胰酶（含0.2 g/L EDTA）和胎牛血清（Hyclone公司），MTT試劑盒（Solarbio公司），羥脯氨酸試劑盒（南京建成科技有限公司），Lipofectamin 2000（Invitrogen公司），大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（欣博盛公司），miR-155 inhibitor及其陰性對照、miRNA PCR試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司），總RNA試劑盒（美國Omega公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（天根生物公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2CFs的分離培養(yǎng)

取10～15只出生 2～3 d的Wistar大鼠，無菌條件下取出心臟，放入預(yù)冷D-Hanks液中洗凈淤血，剪取心室，將組織剪成大小約1 mm3的碎塊，加入0.8 g/L胰蛋白酶2 mL，置于 37 ℃水浴中消化10 min，吹打1 min，吸除上清，再加入0.8 g/L胰蛋白酶2 mL消化2～3 min，吸取上清至5 mL胎牛血清中終止消化，如此反復(fù)10～15次至組織完全消化。用 200 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，收集濾液至離心管中以l 500 r/min離心10 min，將所得細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液重懸，充分吹打后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1 h，棄未貼壁細(xì)胞，加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，取2～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3MTT法檢測CFs增殖情況

取培養(yǎng)狀態(tài)良好的CFs，接種于96孔板，每孔100 μL（5 000個細(xì)胞），培養(yǎng)24 h，分別用不同濃度（0、200、400、600、800 μmol/L）的尿酸處理24 h，加入MTT溶液每孔10 μL，孵育4 h，棄上清，再加入DMSO每孔100 μL，置搖床上低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光度（A）值。每組設(shè)4個復(fù)孔。

1.4羥脯氨酸法檢測CFs膠原含量

取培養(yǎng)狀態(tài)良好的CFs，接種于6孔板培養(yǎng)24 h，分別給予不同濃度的尿酸（0、200、400、600、800 μmol/L）處理24 h，取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書操作，用羥脯氨酸法檢測膠原蛋白含量。

1.5ELISA 法檢測CFs炎性因子表達(dá)

取培養(yǎng)狀態(tài)良好的CFs，接種于6孔板培養(yǎng)24 h，分別給予不同濃度的尿酸（0、200、400、600、800 μmol/L）處理24 h，用ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取培養(yǎng)狀態(tài)良好的CFs，接種于6孔板培養(yǎng)24 h。按照說明書分別將miR-155 inhibitor及其陰性對照與Lipofectamin 2000溫和混勻，室溫孵育20 min，后將混合液加入到各孔中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h。選擇前述實驗結(jié)果較為穩(wěn)定的600 μmol/L尿酸進(jìn)行刺激。實驗設(shè)尿酸組、尿酸+陰性對照組以及尿酸+inhibitor組。采用熒光定量PCR方法檢測各組CFs中miR-155的表達(dá)情況。

1.7熒光定量PCR檢測炎性因子及膠原mRNA的表達(dá)

實驗設(shè)正常對照組（A組）、尿酸組（B組）和尿酸+inhibitor組（C組）。采用熒光定量PCR方法檢測各組CFs中IL-6、IL-1β、TNF-α、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）和Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ） mRNA表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1乳鼠CFs的形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)3～5 d時CFs呈融合狀態(tài)，細(xì)胞大且薄，呈長梭形或多角形，略透明，排列緊密，交叉重疊生長，無自發(fā)搏動。

2.2不同濃度尿酸對CFs增殖的影響

尿酸作用24 h后，400、600、800 μmol/L尿酸組MTT法所測的A值較0 μmol/L尿酸組明顯增加（F=18.46，P<0.05），而200 μmol/L尿酸組與0 μmol/L尿酸組相比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.3不同濃度尿酸對CFs膠原含量的影響

尿酸作用24 h后，400、600、800 μmol/L尿酸組CFs膠原蛋白含量較0 μmol/L尿酸組明顯增加（F=11.82，P<0.05），而200 μmol/L尿酸組與0 μmol/L尿酸組相比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.4不同濃度尿酸對CFs炎性因子表達(dá)的影響

不同濃度尿酸作用24 h后，與0 μmol/L尿酸組相比，200、400、600、800 μmol/L尿酸組CFs炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)均顯著增加（F=29.32～69.76，P<0.05）。見表2。

2.5轉(zhuǎn)染CFs后各組miR-155的表達(dá)

以600 μmol/L尿酸處理細(xì)胞24 h后，尿酸組CFs miR-155的相對表達(dá)量為1.00±0.00，尿酸+陰性對照組為1.07±0.10，尿酸+inhibitor組為0.31±0.08，尿酸+inhibitor組miR-155的相對表達(dá)量明顯低于尿酸組及尿酸+陰性對照組（F=172.65，P<0.05）。

2.6MiR-155對尿酸誘導(dǎo)的CFs中炎性因子及膠原mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測顯示，miR-155 inhibitor可以明顯抑制600 μmol/L尿酸誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β、TNF-α、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)增加（F=72.74～275.32，P<0.05）。見表3。

3討論

高尿酸血癥是一種常見的代謝性疾病，與高血壓、血脂異常、糖代謝受損等密切相關(guān)[5]，是心血管疾病的一個重要的獨立危險因素[4-7]。有臨床研究顯示，在普通人群中，血尿酸水平與左心室肥厚存在獨立相關(guān)性[17];在老年心衰病人中，血尿酸水平與心室重構(gòu)明顯相關(guān)且獨立于腎功能之外[7，18]。動物實驗研究顯示，血尿酸水平升高可以誘導(dǎo)小鼠心室重塑、炎癥、心肌纖維化以及膠原相關(guān)酶的分泌異常[19-21]。在細(xì)胞水平，尿酸可以誘導(dǎo)CFs增殖、內(nèi)皮素-1（ET-1）表達(dá)增加和活性氧（ROS）生成增多等氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]，但是尿酸對CFs膠原合成及炎性因子分泌的影響尚未見報道。

心肌纖維化是心臟受損后，炎癥介導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死、凋亡，ECM異常增多和過度沉積的病理過程。心臟ECM主要由膠原、蛋白多糖、糖蛋白、生長因子和蛋白酶等構(gòu)成，其中的膠原主要是Col-Ⅰ和表1不同濃度尿酸對CFs增殖和膠原合成的影響（n=3，A，±s）尿酸濃度（c/μmol·L-1）細(xì)胞增殖膠原蛋白Col-Ⅲ[23]。生理狀態(tài)時，CFs通過合成膠原、分泌膠原水解酶，合成新膠原蛋白替代老化的膠原蛋白，從而穩(wěn)定心臟ECM的成分和結(jié)構(gòu)[24]。心臟損傷后，受到自分泌和旁分泌的調(diào)控，CFs活化并迅速增殖，向損傷區(qū)域遷移，分泌ECM（主要是膠原），從而促進(jìn)傷口愈合和瘢痕形成[25-26]，當(dāng)心臟持續(xù)接受外界刺激時，則會造成膠原的過度沉積，形成心肌纖維化[27]。本實驗結(jié)果顯示，CFs的增殖能力以及合成Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的量在一定范圍內(nèi)隨尿酸濃度的增加而增加，表明較高濃度的尿酸可以誘導(dǎo)CFs過度合成膠原，導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生。

心臟炎癥可以觸發(fā)CFs的表型轉(zhuǎn)化，增加心肌膠原沉積，是心臟重構(gòu)的一個病理關(guān)鍵[28]。心臟損傷后，CFs可以產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等），募集炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等）到心臟組織中，CFs與炎性細(xì)胞相互作用，引發(fā)心臟炎癥的惡性循環(huán)[29-30]。高尿酸血癥病人血清炎癥指標(biāo)升高，說明高尿酸血癥可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[31]。最近有研究結(jié)果表明，CFs中NLRP3炎癥小體的激活在心臟炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[32-33]。而尿酸可以通過激活NLRP3炎癥小體，釋放促炎性細(xì)胞因子到細(xì)胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[34]。因此，我們推測尿酸可以誘導(dǎo)CFs的炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，一定濃度尿酸可刺激CFs分泌炎性細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α），可見尿酸可以在一定程度上促進(jìn)心臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。

研究已證明，某些microRNAs在某些特定的疾病中過度表達(dá)，它們通過單獨或者聯(lián)合作用調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-155在各種炎癥性心臟病，包括心肌肥大、心肌炎、動脈粥樣硬化和心衰中起重要作用[35]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-155參與心臟重塑的病理過程，miR-155敲除可以改善血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心臟重塑，減輕膠原沉積，而miR-155的過度表達(dá)則可促進(jìn)CFs的表達(dá)轉(zhuǎn)化[12]。本研究通過抑制miR-155表達(dá)來探討miR-155在尿酸誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用，結(jié)果表明miR-155在尿酸誘導(dǎo)的心肌纖維化中起促進(jìn)作用，它參與了CFs的膠原合成及炎性分泌。

綜上所述，尿酸可以通過miR-155促進(jìn)CFs的膠原合成及炎性分泌，抑制miR-155則可減輕上述反應(yīng)，提示靶向miR-155可能作為心肌纖維化的潛在治療方法。

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（本文編輯 馬偉平）