邱新萍　陳瑞琳　周滔　李長(zhǎng)新　?？旅簟钪冁谩∫笮泠●R萬(wàn)千

摘要?目的：觀察降逆清熱化濁方對(duì)非糜爛性胃食管反流?。∟ERD）大鼠模型食管組織降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的影響。方法：選取SD雄性大鼠60只并將其分為正常組、模型組、西藥組和中藥組。以雞卵清蛋白/氫氧化鋁基礎(chǔ)致敏聯(lián)合食管酸灌注的方法制備NERD大鼠模型，藥物干預(yù)14 d后，觀察各組大鼠食管組織的病理改變及高敏感性相關(guān)信號(hào)分子CGRP的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠食管組織上皮細(xì)胞間隙增寬，有少量炎性細(xì)胞;與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠食管組織CGRP表達(dá)明顯降低，且中藥組降低更為顯著。結(jié)論：降逆清熱化濁方通過(guò)抑制CGRP的表達(dá)，下調(diào)食管高敏感性，從而對(duì)NERD起到治療作用。

關(guān)鍵詞?胃食管反流;降逆清熱化濁方;食管高敏感性;大鼠;降鈣素基因相關(guān)肽;上皮細(xì)胞

Study of Effects on Jiangni Qingre Huazhuo Prescription on Calcitonin Gene Related Peptide in Rats with Non-erosive Gastroesophageal Reflux Disease

Qiu Xinping1，Chen Ruilin2，3，Zhou Tao2，Li Changxin1，Niu Kemin1，Yang Zhongting2，3，Yin Xiuwen2，3，Ma Wanqian1

（1 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Shunyi Branch，Beijing 101300，China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China; 3 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Jiangni Qingre Huazhuo Prescription on the esophageal tissue CGRP in rats with non-erosive gastroesophageal reflux disease（NERD）. Methods：Sixty male SD rats were divided into the normal group，model group，western medicine group and Chinese medicine group. The NERD rat model was prepared by chicken ovalbumin/aluminum hydroxide sensitization combined with esophageal acid perfusion. After 14 days of drug intervention，the pathological changes of esophageal tissue and the calcitonin gene related peptide（CGRP）of high-sensitivity-related signaling molecule was observed. Results：Compared with the normal group，the esophageal tissue epithelial cells in the model group were widened and a small amount of inflammatory cells were present. Compared with the model group，the expression of CGRP in the esophageal tissue of the rats in the Chinese medicine group and the western medicine group was significantly reduced. The decreased range of Chinese medicine group was more significant than that of the western medicine group. Conclusion：Jiangni Qingre Huazhuo Prescription can get therapeutic effects of non-erosive gastroesophageal reflux disease by inhibiting expression of CGRP and down-regulate the high sensitivity of esophagus.

Key Words?Gastroesophageal reflux; Jiangni Qingre Huazhuo Prescription; Esophageal hypersensitivity; Rats; Calcitonin gene related peptide; Epithelial cells

中圖分類號(hào)：R289.5;R573.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.019

胃食管反流?。℅astroesophageal Reflux Disease，GERD）是胃內(nèi)容物反流入食管、口腔所引起的，以反酸、燒心、吞咽疼痛為主要不適癥狀的一種疾病[1]。其中，具有胃食管反流引起的不適癥狀，且近期未予以抑酸治療，內(nèi)鏡下未發(fā)現(xiàn)食管黏膜損傷的一種GERD亞型為非糜爛性胃食管反流病（Non-erosive Gastroesophageal Reflux Disease，NERD），又稱內(nèi)鏡陰性胃食管反流病，占GERD的50%～70%[2-3]。NERD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前多認(rèn)為與酸反流、非酸相關(guān)性刺激、內(nèi)臟高敏感等相關(guān)[4-5]。NERD根據(jù)其臨床特征可歸入中醫(yī)學(xué)“反酸”“嘈雜”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為其主要病機(jī)為“胃氣上逆、胃火熾盛、濁邪上泛”，故治療當(dāng)以降逆清熱化濁為主[6]。本研究主要通過(guò)建立食管高敏感性NERD大鼠模型，觀察降逆清熱化濁方干預(yù)下NERD大鼠食管高敏感性相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況，以探討降逆清熱化濁方對(duì)NERD食管高敏感性的影響及其治療NERD的作用機(jī)制。

1?材料

1.1.1?動(dòng)物

選取雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量150～160 g，動(dòng)物批號(hào)為11401500034143，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，自由攝食與飲水。自由攝食與飲水，飼養(yǎng)3 d，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.2?藥物

降逆清熱化濁方由柴胡12 g、白芍10 g、枳實(shí)15 g、厚樸15 g、陳皮10 g、吳茱萸3 g、黃連10 g等藥物組成，中藥顆粒劑購(gòu)自廣東一方制藥有限公司。奧美拉唑腸溶片購(gòu)自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20044871。

1.1.3?試劑與儀器

試劑：OVA雞蛋清白蛋白，購(gòu)自Bioruler百奧百樂(lè)生物科技有限公司;抗大鼠CGRP多克隆抗體，購(gòu)自Proteintech公司;抗大鼠P物質(zhì)多克隆抗體，購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司;氫氧化鋁、烏拉坦，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。奧林巴斯BX41顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

分組：將60只大鼠隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、中藥組、西藥組，每組15只。其中模型組、中藥組及西藥組大鼠均在實(shí)驗(yàn)第1天予以卵清蛋白/氫氧化鋁混合液行腹腔注射，正常組大鼠予等量生理鹽水行腹腔注射。從實(shí)驗(yàn)第2天開(kāi)始，中藥組、西藥組大鼠分別予以疏肝和胃方（0.625 g/mL，相當(dāng)于成人用藥量5倍）及奧美拉唑溶液（0.167 mg/100 g體質(zhì)量，相當(dāng)于成人用藥量5倍）10 mL/kg體質(zhì)量灌胃，正常組和模型組大鼠均予以等量生理鹽水（10 mL/kg體質(zhì)量）灌胃。連續(xù)給藥2周，至第14天結(jié)束給藥，并進(jìn)行食管酸灌注，采集大鼠食管標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

食管高敏感性的GERD大鼠模型的制備[7]：選擇雞卵清蛋白/氫氧化鋁基礎(chǔ)致敏聯(lián)合食管酸灌注的方法制備內(nèi)臟高敏感性NERD大鼠模型。在實(shí)驗(yàn)第1天即用卵清蛋白和氫氧化鋁佐劑的混合液1.5 mL（卵清蛋白100 mg/氫氧化鋁200 mg）行腹腔注射，進(jìn)行基礎(chǔ)致敏;在實(shí)驗(yàn)第14天進(jìn)行食管酸灌注。

食管酸灌注方法如下：酸灌注前禁食24 h，予以10%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉，大鼠麻醉后將頭部抬高20°～30°平臥固定;切開(kāi)腹壁暴露胃壁，并在近賁門(mén)處切一小圓孔，通過(guò)小圓孔放置引流管，用以收集從灌注的液體;將一單腔灌流管一端經(jīng)口置食管內(nèi)，并固定在食管和胃交界處上2～3 cm處，另一端與持續(xù)灌注泵相連，使用0.1 mol/L鹽酸以10 mL/h的速度滴注50 min。

1.2.2?干預(yù)方法

中藥組：疏肝和胃方（0.625 g/mL，相當(dāng)于成人用藥量5倍），10 mL/kg體質(zhì)量灌胃;西藥組：奧美拉唑溶液（0.167 mg/100 g體質(zhì)量，相當(dāng)于成人用藥量5倍）10 mL/kg體質(zhì)量灌胃;正常組和模型組：生理鹽水10 mL/kg體質(zhì)量灌胃。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

大鼠食管組織病理學(xué)檢測(cè)：自賁門(mén)向口腔方向剪取1 cm左右長(zhǎng)度的食管組織，用10%中性甲醛固定，依次進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片厚度為4 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。鏡下觀察食管組織病理學(xué)改變。

大鼠食管組織CGRP水平檢測(cè)：大鼠食管組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，檸檬酸高壓熱修復(fù)2.5 min，過(guò)氧化氫作用10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入大鼠CGRP抗體（抗體濃度1∶50），在37 ℃條件下孵育1 h，加入酶標(biāo)羊血清抗小鼠/兔二抗，在室溫下孵育20 min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。鏡下讀片，棕褐色團(tuán)塊即為CGRP陽(yáng)性表現(xiàn)。

2?結(jié)果

2.1?一般情況

正常組大鼠的行為活躍，體質(zhì)量正常增加;與正常組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量增加較少、精神萎靡、行為不活躍，而中藥組和西藥組大鼠體質(zhì)量稍增加，精神稍差，活動(dòng)尚可。

2.2?大鼠食管組織病理學(xué)

模型組、中藥組、西藥組大鼠食管黏膜除上皮細(xì)胞層內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞外，均未見(jiàn)鱗狀上皮增生和黏膜糜爛等明顯病理變化;正常組大鼠黏膜上皮細(xì)胞層內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯病理變化。見(jiàn)圖1。

2.3?大鼠食管組織CGRP表達(dá)

與正常組比較，模型組大鼠食管組織CGRP陽(yáng)性表達(dá)明顯增多;與模型組比較，中藥組與西藥組大鼠食管組織CGRP陽(yáng)性表達(dá)均有明顯減少，且中藥組減少更為顯著。見(jiàn)圖2。

3?討論

NERD根據(jù)其燒心、反酸、噯氣、胸骨后灼痛、咽部如有梗死感等癥狀臨床特征可歸入中醫(yī)學(xué)“吞酸”“嘈雜”等范疇?！端貑?wèn)·至真要大論》曰：“諸嘔吐酸，皆屬于熱”?！鹅`樞·四時(shí)氣論》云：“善嘔，嘔有苦……邪在膽，逆在胃，膽液泄則口苦，胃氣逆則嘔苦”?！端貑?wèn)玄機(jī)原病式·吐酸》云：“酸者，肝木之味也。由火盛制金，不能平木，則肝木自甚，故為酸也”。諸多醫(yī)家認(rèn)為NERD病機(jī)屬熱，與肝、膽、胃有關(guān)。關(guān)于病因，中醫(yī)認(rèn)為該病多由情志失調(diào)、飲食不節(jié)、素體脾胃虛弱等所致?！堆C論》載：“木之性主疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化”。肝屬木，脾胃屬土，五行生克制化，肝木克土，當(dāng)情志失調(diào)，肝氣郁滯，或氣郁化火，肝火亢盛，則傷脾胃，脾胃失和，胃氣上逆而發(fā)病。肝膽同處膈下，互為表里，在生理上相互依賴，在病理上相互影響，膽經(jīng)受邪亦會(huì)影響肝經(jīng)疏泄;或飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚膩，致痰濕內(nèi)生，阻滯氣機(jī)，脾胃升降失常;或素體脾胃虛弱，或久病傷及脾胃，土虛木乘，運(yùn)化失常，故該病位在食管，屬脾胃所主，但與肝、膽關(guān)系密切。

馬萬(wàn)千主任醫(yī)師認(rèn)為，NERD的主要病機(jī)為肝失疏泄，氣滯化熱犯胃，胃氣上逆，脾胃升降失常，運(yùn)化失司，濁邪內(nèi)生并隨氣逆上泛，其中“胃氣上逆、胃火熾盛、濁邪上泛”為病機(jī)關(guān)鍵[6]。以此為依據(jù)，并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，馬萬(wàn)千主任醫(yī)師提出治療NERD當(dāng)以“降逆”為切入點(diǎn)，以“降逆疏肝、清熱化濁”為主要大法，自擬降逆清熱化濁方，藥用柴胡、白芍、枳實(shí)、厚樸、陳皮、吳茱萸、黃連、甘草、蒼術(shù)等，臨床療效顯著?！端貑?wèn)·六元正紀(jì)大論》曰：“木郁達(dá)之”。與反流性食管炎比較，NERD患者有更明顯的焦慮傾向，生命質(zhì)量和心理健康程度也偏低。當(dāng)今社會(huì)環(huán)境下，人們承受著越來(lái)越大的生活和工作壓力，出現(xiàn)焦慮與抑郁等情志不暢者日益增加，NERD的患者也逐漸增多。焦慮和抑郁等情緒都與肝失疏泄明顯相關(guān)，故擬方首選柴胡利肝膽、疏肝解郁，白芍?jǐn)筷幦岣?，厚樸以溫中下氣，枳?shí)破氣消積，同為降逆之品，降逆疏肝，肝脾同治;“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。故同時(shí)配伍陳皮健脾順氣，蒼術(shù)燥濕健脾;肝郁日久，容易化火生熱，亦配伍黃連清脾胃之火，吳茱萸以防寒涼之品遏傷脾胃之陽(yáng)，諸藥合用共奏降逆疏肝，清熱和胃之效。

西醫(yī)治療NERD的主要藥物包括質(zhì)子泵抑制劑（PPI）、胃腸動(dòng)力藥等，但臨床上存在很大一部分患者在服用PPI后，反酸、燒心等癥狀并不能得到有效緩解。且西藥目前尚存在用藥較為單一，不良反應(yīng)較為明顯，而患者的生命質(zhì)量及焦慮抑郁等情況改善并不十分理想等不足之處，且長(zhǎng)期維持用藥給患者及家庭造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療NERD具有一定的優(yōu)勢(shì)和特色。在上述馬萬(wàn)千主任醫(yī)師對(duì)NERD病機(jī)認(rèn)識(shí)和組方用藥的相關(guān)思想指導(dǎo)下，我們前期臨床觀察降逆清熱化濁方（柴胡12 g、白芍10 g、枳實(shí)15 g、厚樸15 g、陳皮10 g、吳茱萸3 g、黃連10 g、甘草10 g、蒼術(shù)10 g等）治療肝胃不和型NERD患者60例，總有效率98%，且在RDQ評(píng)分、中醫(yī)證候積分、主要單項(xiàng)癥狀計(jì)分、生命質(zhì)量量表積分等方面的改善明顯優(yōu)于口服雷貝拉唑腸溶膠囊治療的對(duì)照組（P<0.05），證明了降逆清熱化濁方的臨床療效[8]。本研究探討及驗(yàn)證降逆清熱化濁方治療NERD的作用機(jī)制，明確中醫(yī)藥治療該病的療效及優(yōu)勢(shì)，以期在臨床上更廣泛應(yīng)用及推廣。

NERD的發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多認(rèn)為其與食管清除能力下降、食管及胃排空功能障礙、內(nèi)臟高敏感及情志等因素相關(guān)。但臨床應(yīng)用PPI治療NERD患者的療效反饋通常不佳，對(duì)NERD患者食管24 h反流監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，大部分患者的酸反流屬于生理范圍。由此推測(cè)，胃酸并非NERD的主要致病因素，可能與食管高敏感性相關(guān)，故即使是生理量的反流物也可導(dǎo)致食管高敏感性的NERD患者產(chǎn)生反酸、燒心等癥狀。

目前已有較多研究證實(shí)食管內(nèi)臟高敏感性可能是NERD重要的病理生理基礎(chǔ)。內(nèi)臟高敏感性（Visceral Hypersensitivity，VH）是指內(nèi)臟對(duì)疼痛或刺激的感知閾值降低，對(duì)生理性刺激產(chǎn)生不適感或?qū)π源碳し磻?yīng)強(qiáng)烈。NERD患者對(duì)食管酸刺激、機(jī)械性刺激、膽堿能藥物的敏感性增強(qiáng)，即為食管高敏感性。注：降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）是重要的感覺(jué)神經(jīng)遞質(zhì)，降低疼痛閾值，增加內(nèi)臟敏感性[8]。CGRP即是食管高敏感性相關(guān)的重要信號(hào)分子之一，CGRP是重要的感覺(jué)神經(jīng)遞質(zhì)，降低疼痛閾值，增加內(nèi)臟敏感性。CGRP含量的增加可引起食管黏膜的神經(jīng)末梢處于興奮狀態(tài)，并導(dǎo)致“神經(jīng)源性炎癥”，從而使局部微環(huán)境發(fā)生改變，引起患者痛覺(jué)過(guò)敏[9]。有研究顯示，CGRP在NERD患者的食管黏膜中高表達(dá)[10]。CGRP是外周神經(jīng)系統(tǒng)中，參與痛覺(jué)信息傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)。食管的支配神經(jīng)發(fā)出大量纖維末梢分布于食管壁全層，這些末梢中含有大量的CGRP。食管受到刺激后，信號(hào)傳入引起CGRP等神經(jīng)活性物質(zhì)釋放，作用于相應(yīng)神經(jīng)支配區(qū)使肥大細(xì)胞脫顆粒而釋放各種細(xì)胞因子及炎性反應(yīng)遞質(zhì)，引起血管擴(kuò)張，通透性增加，血漿蛋白外滲等神經(jīng)源性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)臟感知閾值下降，即食管內(nèi)臟高敏感性[11-13]。張秀蓮[14]分別測(cè)定CERD患者及正常人食管黏膜中CGRP的含量，結(jié)果顯示CERD患者食管組織中CGRP的表達(dá)較正常人明顯增多，從而推測(cè)NERD的食管高敏感性與CGRP高表達(dá)相關(guān)。牛小平等[15]分別檢測(cè)CERD患者及正常人血清中CGRP的含量，檢測(cè)結(jié)果顯示NERD患者血清CGRP表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）;且CGRP表達(dá)水平與GerdQ評(píng)分呈正相關(guān)，由此可知NERD患者血清CGRP表達(dá)明顯增加，與反流癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，CGRP參與了NERD的病理過(guò)程，是其內(nèi)臟高敏性的重要機(jī)制。

綜上所述，模型組大鼠的食管組織上皮細(xì)胞層內(nèi)存在炎性細(xì)胞，與NERD的病理學(xué)變化相符。中藥組及西藥組大鼠食管組織病理改變減輕，表明降逆清熱化濁方對(duì)NERD具有明確的治療效果。且降逆清熱化濁方能夠顯著降低NERD模型大鼠食管組織中CGRP的表達(dá)，對(duì)其食管高敏感性具有明顯的抑制作用。由此可以得出結(jié)論，降逆清熱化濁方可能是通過(guò)下調(diào)食管CGRP的表達(dá)，降低食管高敏感性從而對(duì)NERD起到治療作用。但本實(shí)驗(yàn)關(guān)于食管高敏感性的研究較為單一，有待更深入的研究，以明確中醫(yī)藥的作用機(jī)制及優(yōu)勢(shì)環(huán)節(jié)，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的價(jià)值。

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