譚靜　林亞平　趙歡　彭卓雋　歐陽里知　陳欲攀　石俊林

摘要?目的：觀察艾灸對胃荷瘤大鼠外周血中CD4+、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞亞群的影響。方法：將50只健康SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、艾灸組和紅外組5組，每組10只。利用Walker-256細(xì)胞來源的實體瘤組織移植胃部制備模型。模型成功后，艾灸組予以懸灸中脘、胃俞等穴位;紅外組予以短波紅外線照射腹部胃脘及背部胃脘投影區(qū);其余組捆綁束縛。干預(yù)20 min/次，1次/d，持續(xù)21 d。干預(yù)結(jié)束后，眼眶采血，流式細(xì)胞技術(shù)測定外周血中CD4+、CD4+CD25+T淋巴比例。處死動物，測算胸腺指數(shù)及腫瘤體積生長抑制率。結(jié)果：與空白組比較，模型組動物生存狀態(tài)變差，胸腺指數(shù)增加，外周血中CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，艾灸組動物艾灸組動物生存狀態(tài)改善，胸腺指數(shù)進一步增加，瘤體內(nèi)壞死灶較多，血管較少，外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例減少（P<0.01）;與紅外組比較，艾灸組瘤體內(nèi)壞死灶更多，血管較少，外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例增加（P<0.01）。結(jié)論：艾灸可一定程度改善荷瘤動物生存狀態(tài)，減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進腫瘤細(xì)胞壞死，減少血管增生。這種影響可能與增加CD4+T淋巴細(xì)胞，減少CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞有關(guān)。

關(guān)鍵詞?艾灸;胃癌;胸腺指數(shù);CD4+;CD4+CD25+;大鼠

Effects of Moxibustion on CD4+ and CD4+CD25+ T Lymphocytes in Peripheral Blood of Rats with Gastric Tumor

Tan Jing，Lin Yaping，Zhao Huan，Peng Zhuojun，Ouyang Lizhi，Chen Yupan，Shi Junlin

（School of Acupuncture，Moxibustion and Tuina，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of moxibustion on CD4+ and CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood of rats with gastric cancer. Methods：A total of 50 healthy SPF SD rats（half male and half female）were randomly divided into 5 groups：the blank group，the sham operation group，the model group，the moxibustion group and the infrared group，with 10 rats in each group. Solid tumor tissue derived from Walker-256 cells was transplanted into the stomach to prepare the tumor model. After modeling，moxibustion group and infrared group were treated 20 mins per day for 21 days. After the intervention，the blood from the orbits was collected. And the ratio of CD4+ and CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood was tested by flow cytometry. After killing the rats，the thymus index and the growth inhibition rate of the tumor volume were measured. Results：Compared with the blank group，the survival status of the model group was worse，the thymus index increased，and the proportion of CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood significantly increased（P<0.05）. Compared with the model group，the survival status of the moxibustion group was improved，the thymus index was further increased，more necrosis and less blood vessels were found in the tumors，and the percentage of CD4+ T lymphocytes was increased significantly（P<0.01），while that of CD4+CD25+ T lymphocyte was decreased（P<0.01）. Compared with the infrared group，more necrosis and few blood vessels were found in the tumors，and the proportion of CD4+ T lymphocytes was increased in the moxibustion group（P<0.01）. Conclusion：Moxibustion can improve the survival status of the rat with gastric tumor，inhibit tumor metastasis，promote tumor necrosis as well as prevent vessels hyperplasia. These changes may be related to the increasing CD4+ T lymphocytes and the decreasing CD4+CD25+ T lymphocytes.

Key Words?Moxibustion; Gastric cancer; Thymus index; CD4+; CD4+CD25+; Rat

中圖分類號：R245.8文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.001

胃癌（Gastric Carcinoma）是消化道最常見的惡性腫瘤，常以上腹部不適、疼痛、嘔吐等為主要癥狀[1]。受地域環(huán)境及飲食習(xí)慣的影響，我國胃癌的發(fā)病率、死亡率遠高于全球平均水平[2]。胃癌的防治一直是我國醫(yī)學(xué)研究的重點。近年來，研究者抓住“腫瘤細(xì)胞更不耐高溫”的特點，利用紅外線、微波等的輻射能對腫瘤局部或全身加溫，從調(diào)節(jié)免疫功能出發(fā)探索熱療抗腫瘤的作用機制，取得了一定進展[3-4]。目前，熱療已成為臨床第五大抗癌療法。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中不乏利用“熱”來防治疾病的方法，如艾灸、火針等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，艾灸主要通過燃燒時釋放的各種光線的熱刺激，激活穴位、經(jīng)絡(luò)產(chǎn)生復(fù)雜的反饋應(yīng)答，實現(xiàn)對機體的“溫補”與“溫通”。我們的前期發(fā)現(xiàn)，艾灸可對抗多種刺激下的胃黏膜損傷[5-7]，能明顯激活胃荷瘤大鼠外周血中自然殺傷細(xì)胞（NK）、自然殺傷性T細(xì)胞（NKT），但對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及其他T細(xì)胞亞群的影響未作進一步研究[8]。本實驗再次以胃荷瘤大鼠為實驗對象，觀察艾灸對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，腫瘤組織形態(tài)學(xué)及外周血中CD4+、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的影響，探索艾灸對抗胃癌的療效及可能的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

160～180 g SPF級SD大鼠6只，雄性，用于瘤組織制備;200～240 g SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，用于分組實驗。上述動物由中國食品藥品檢定研究院動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0013，使用許可證號：SYXK（京）2014-0003。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動物實驗中心完成。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（25±1）℃，相對濕度50%～70%，12 h晝夜節(jié)律交替。實驗前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗過程符合有關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。

1.1.2?試劑與儀器

Walker-256細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院饋贈）、戊巴比妥鈉（Biotobbed）、淋巴細(xì)胞分離液（華美生物）、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（B&D）、大鼠CD3-APC（eBioscience）、CD4-PE（eBioscience）、CD25-PerCP-eFluorTM 710（eBioscience）、單抗（Sigma）;流式細(xì)胞儀（LSRII型，Becton Dickinson）、低速離心機（LD5-10B型，北京京立）、紅外線治療儀（6002B型，徐州天飛）、數(shù)顯表面測溫儀（浙江波仕歐）、直徑0.7 cm艾條（長沙艾醫(yī)生物）、自制小動物艾灸架。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

分組方法：實驗分為空白組、假手術(shù)組、模型組、艾灸組、紅外組5組。隨機數(shù)字表法對動物編號。通過下述方法制備動物模型，成模后，隨機分入模型組、艾灸組及紅外組。手術(shù)模擬皮下實體瘤組織胃壁移植過程，成功后，隨機分入假手術(shù)組。每組動物10只，雌雄各半，共計50只動物。

參考文獻[9]，按照以下3步制備動物模型。1）腹水瘤制備：160～180 g大鼠分別腹腔注射0.3 mL Walker-256細(xì)胞的懸液（2×107個/mL，3只）。2）皮下實體瘤制備：待形成明顯腹水（腹腔注射7 d）后處死動物，收集腹水中的瘤細(xì)胞，調(diào)整至0.5×107個/mL，皮下注射于160～180 g的大鼠右前、右后肢（0.2 mL/部位，3只）。3）手術(shù)移植：待皮下注射處形成橄欖核大小的實體瘤后，處死動物，無菌條件下切開瘤體，取大小0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm新鮮魚肉樣瘤組織手術(shù)縫合于待移植大鼠胃大彎皮、腺區(qū)交界的胃壁上，荷瘤大鼠體質(zhì)量200～240 g。7 d后剖腹探查判斷造模是否成功。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：移植處瘤體已附生在胃壁上，直徑0.5 cm以上，邊界清晰，表面光滑，無粘連及臟器侵犯，組織學(xué)證實與皮下實體瘤同源。見圖1。

1.2.2?給藥方法

造模成功的第2天，艾灸組《針灸基礎(chǔ)與臨床》[10]中大鼠穴位定位方法，仰臥位固定施灸中脘、關(guān)元、足三里（雙），隔日俯臥位固定施灸脾俞（雙）、胃俞（雙）。施灸時，將直徑7 mm艾條通過自制艾灸架在穴位垂直上方固定并點燃施灸。利用表面測溫儀監(jiān)測表皮溫度，適時去除艾灰、調(diào)整施灸高度，確保溫度持續(xù)在（42±1）℃之間。每次施灸20 min，1次/d，連續(xù)21 d。紅外組于造模成功后第2天，使用波長0.4～3 μm的短波紅外線照射，強度1檔、輸出功率10 W、光斑直徑3 cm，隔日交替照射胃脘部及背部T11至T13區(qū)域，治療時溫度控制、治療時間、頻次、療程等與艾灸組相同。空白、假手術(shù)、模型組動物在同一時間段，隔日仰臥、俯臥交替捆綁束縛。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

1）生存狀態(tài)積分評定：自開始干預(yù)起，每隔5 d對各組動物的生存狀態(tài)進行評定。見表1。

2）外周血CD4+、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞檢測：干預(yù)結(jié)束后的第2天，禁食不禁水12 h后，眼眶采血2 mL，24 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測。檢測時，取100 μL血樣，分別加入適量的CD3-APC、CD4 PE、CD25-PerCP-eFluorTM 710熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育20 min后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫反應(yīng)10 min;300 g離心5 min，棄上清，加入2 mLPBS混勻，300 g離心5 min，棄上清;加入500 μL PBS混勻上流式細(xì)胞儀，通過FACS Diva6.0分析軟件獲取分析。

3）胸腺指數(shù)測量：采血后，處死動物，無菌環(huán)境下剖開胸，摘取胸腺，PBS沖洗后，無菌紗布吸干水分后，用電子精密天平測量重量，按照胸腺重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）計算胸腺指數(shù)。

4）腫瘤生長抑制率：動物處死后，無菌環(huán)境下剖開腹腔，手術(shù)線結(jié)扎大鼠幽門部和賁門部，在兩結(jié)扎線之間剪下全胃，PBS溶液輕柔沖洗，無菌紗布吸干多余水分后將胃平攤于定型濾紙，暴露腫瘤部位，用電子游標(biāo)卡尺測量胃部瘤體的最長徑（a），最小徑（b），根據(jù)公式V=（π/6）×[（a+b）/2]3，計算出腫瘤的體積。按照（模型組腫瘤體積均值-實驗組腫瘤體積均值）/模型組腫瘤體積均值×100%計算腫瘤生長抑制率。

5）腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察：取腫瘤組織，4%低聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，普通光鏡下觀察腫瘤組織壞死，血管等情況。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。所有數(shù)據(jù)資料進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性時，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時用LSD法檢驗，不齊時用Dunnett T3法檢驗。不滿足正態(tài)性時，采用秩和檢驗。以P<0.05定義差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?生存狀態(tài)狀態(tài)積分

在觀察時間內(nèi)，各組均未見動物死亡。與空白組比較，模型組成模后第5日起生存狀態(tài)積分持續(xù)降低（P<0.01）。干預(yù)15 d后，與模型組比較，艾灸組、紅外組動物生存狀態(tài)改善，積分值增加（P<0.01，P<0.05），且艾灸組明顯優(yōu)于紅外組（P<0.05）;干預(yù)20 d后，艾灸組積分與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.2?腫瘤增長抑制率

干預(yù)期間內(nèi)無動物死亡。干預(yù)結(jié)束后，處死動物開腹探查后發(fā)現(xiàn)模型組、艾灸組、紅外組均有瘤體破潰消失，其中模型組1只，艾灸組6只、紅外組3只。各組均有腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其中以紅外治療、腹水轉(zhuǎn)移最常見。見表2。如圖3所示，與模型組比較，艾灸組、紅外組胃部所荷瘤體體積明顯減小（P<0.05）。經(jīng)計算，體積生長抑制率分別為41.89%、28.09%。

2.3?瘤體形態(tài)學(xué)觀察

模型組瘤體內(nèi)出現(xiàn)大量增生的血管，較少有壞死灶;艾灸組瘤體內(nèi)出現(xiàn)大量壞死灶，血管較少;紅外組瘤體內(nèi)盡管出現(xiàn)了一定量壞死灶，但也有一定量血管增生。見圖4。

2.4?胸腺指數(shù)

與空白組比較，模型組胸腺指數(shù)增高（P<0.05）;與模型組比較，艾灸組胸腺指數(shù)顯著增高（P<0.01）;與紅外組比較，艾灸組胸腺指數(shù)增加明顯（P<0.05）。見圖5。

2.4?外周血中CD4+、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例

與空白組比較，模型組外周血中CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，艾灸組外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例減少。與紅外組比較，艾灸組外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例增加更明顯（P<0.01）。見圖6、圖7。

3?討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，已經(jīng)給社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。預(yù)計到2020年中國每年的惡性腫瘤死亡總數(shù)將達300萬，患病總數(shù)將達660萬[11]。目前，惡性腫瘤的治療方法主要仍為手術(shù)根治及放化療。但其治療范圍的局限性及較普遍、明顯的不良反應(yīng)，促使抗瘤的新技術(shù)、新方法不斷被探索。近年來，研究者抓住腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞更不耐高溫的特點，利用紅外線、微波等對實體瘤局部表皮進行照射。發(fā)現(xiàn)，通過將腫瘤內(nèi)溫度升高至42 ℃后，腫瘤內(nèi)的溫度較正常組織高1～2 ℃，這樣既不會傷害正常組織，又能殺死腫瘤細(xì)胞[12]。在這種高溫環(huán)境下，一方面，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜的流動性、通透性增加，細(xì)胞內(nèi)酶失活、DNA合成受阻、代謝抑制，腫瘤細(xì)胞將程序化死亡[13];另一方面，熱刺激可誘導(dǎo)大量抗瘤因子如熱休克蛋白等的表達、釋放，使抗體、抗原結(jié)合更容易、更緊密，增強機體對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷[14]。由于腫瘤內(nèi)血管豐富，血液中水分、血紅蛋白能吸收大量光線而升溫并使血液循環(huán)加快，對血管壁的壓力增加，進而引起實體瘤組織的壞死、破潰[13，15]。因此，熱療已成為臨床第五大抗瘤療法。

近年來，隨著國家對中醫(yī)藥發(fā)展的日益重視，艾灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成已積極應(yīng)用于惡性腫瘤的對癥治療中，如減輕術(shù)后腹脹、嘔吐，改善放化療后的骨髓抑制，增強免疫功能等[15-16]，但對艾灸直接的腫瘤抑制作用觀察較少。與現(xiàn)有熱療技術(shù)比較，艾灸具有多種潛在優(yōu)勢。一方面，艾灸輻射的是以短波紅外線為主的綜合光線，各種光線的比例可隨著燃燒時間不斷變化，因此效應(yīng)廣、作用深、難耐受[17]。另一方面，艾灸時釋放的艾煙具有空氣消毒、抑菌殺菌、抗感染、清除自由基等作用[18]。本研究中，艾灸控制表皮溫度在42 ℃時，動物沒有明顯的掙扎、撕叫等應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)艾灸治療21 d后，腫瘤體積、轉(zhuǎn)移例數(shù)明顯小于（少于）模型組，同時瘤體內(nèi)血管較少、壞死灶較多，提示艾灸具有一定的腫瘤抑制作用。然而，艾灸通過什么方式起效？

研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體免疫，特別是淋巴細(xì)胞的狀態(tài)密切相關(guān)。淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）是體積最小的白細(xì)胞，可分為T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）、B淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。T細(xì)胞和B細(xì)胞都是抗原特異性淋巴細(xì)胞，分別參與細(xì)胞免疫及體液免疫，其中T細(xì)胞的影響更大[19]。T淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多功能干細(xì)胞，在胸腺中分化成熟后布到全身各處。T細(xì)胞表達多種重要的膜分子，它們參與T細(xì)胞識別抗原、活化、增殖。其中，CD4+T細(xì)胞能在抗原提呈細(xì)胞的協(xié)助下，可識別腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，繼而釋放多種細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4等），促進B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活，幫助其殺傷腫瘤細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞具有多種亞群，其中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）于20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)，因具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用，一直是研究的熱點。研究表明[20]，Treg細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子、細(xì)胞接觸抑制2種方式調(diào)節(jié)腫瘤免疫，幫助腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)免疫逃逸。一方面，Treg細(xì)胞通過分泌TGF-β、IL-10等多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。如TGF-β可抑制由NK細(xì)胞激活受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，減少NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷[21-22];通過分泌顆粒酶（Granzyme），誘導(dǎo)靶細(xì)胞壞死[23];通過競爭性結(jié)合IL-2后促進自身增殖、分化，增強對效應(yīng)T細(xì)胞的免疫[24];通過調(diào)節(jié)核因子（NF-κB）受體活化因子及其配體受體信號的途徑對腫瘤的轉(zhuǎn)移起促進作用[25]。另一方面，Treg細(xì)胞可通過T細(xì)胞上的跨膜受體CTLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞接觸抑制抗瘤發(fā)揮效應(yīng)[26]。臨床研究表明[27-28]，胃癌等多種類型腫瘤患者的外周血和腫瘤組織內(nèi)Treg細(xì)胞均呈高表達，其細(xì)胞數(shù)量與腫瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。手術(shù)及放化療治療后，外周血中Treg細(xì)胞數(shù)目減少，其可能作用方式是通過抑制癌灶微環(huán)境中血管的生成，加速凋亡進程有關(guān)[29-30]。我們的前期研究表明，艾灸能明顯組成荷瘤大鼠外周血中NK、NKT細(xì)胞的激活[8]。本次研究表明艾灸具有一定的腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用，瘤體中的血管明顯減少，上述發(fā)生或許與減少外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞有關(guān)。然而，艾灸后外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯增加，提示艾灸或?qū)ζ渌鸗細(xì)胞亞群也有作用。同時，CD4+CD25+T細(xì)胞的激活途徑及后續(xù)影響等均有待進一步研究。

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