陳海玲 路雪林 葉泉清 唐紹清

摘要：薄葉金花茶、小花金花茶和小瓣金花茶是三種瀕危金花茶植物，為了解珍稀瀕危植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，該研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)他們的7個(gè)種群共184個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：11個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到等位基因92個(gè)。在物種水平上，小瓣金花茶平均等位基因數(shù)（NA）為3.9、有效等位基因數(shù)（NE）為2.328、觀測(cè)雜合度（Ho）為0.520、期望雜合度（He）為0.501，高于薄葉金花茶和小花金花茶。在種群水平上，有效等位基因數(shù)（NE）在1.788～2.466之間，期望雜合度（He）在0.379～0.543之間;種群間遺傳分化系數(shù)（FST）在0.1437～0.4533之間，種群間基因流（Nm）在0.3015～1.4889之間。AMOVA分子變異分析顯示65.72%的變異存在于種群內(nèi)。三種金花茶具有較低水平的遺傳多樣性和高水平的種群間遺傳分化。STRUCTURE和PCoA種群遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果將取樣種群分為2組，即薄葉金花茶和小花金花茶大部分個(gè)體分為一組，小瓣金花茶大部分個(gè)體分為一組?，F(xiàn)存所有種群應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況盡快采取就地保護(hù)或遷地保護(hù)措施。

關(guān)鍵詞：薄葉金花茶，小花金花茶，小瓣金花茶，遺傳多樣性，遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）03-0318-10

薄葉金花茶（Camelliachrysanthoides）（2n=30）、小花金花茶（C.micrantha）（2n=30）和小瓣金花茶（C.parvipetala）（2n=30）是分布于我國(guó)廣西西南部的三種金花茶植物（張宏達(dá)和任善湘，1998;梁盛業(yè)，1995）。薄葉金花茶分布于廣西龍州縣大青山，小花金花茶分布于廣西憑祥市夏石鎮(zhèn)，小瓣金花茶分布于廣西寧明縣，他們的分布區(qū)接近且極其狹窄。土地的開(kāi)發(fā)和利用導(dǎo)致他們的生境被破壞;且因他們具有一定的觀賞價(jià)值，部分野生植株被當(dāng)?shù)鼐用褚浦?。因此，這3個(gè)物種的野生種群大小迅速減小，并呈片斷化分布。薄葉金花茶和小花金花茶已被《中國(guó)高等植物受威脅物種名錄》列為瀕危物種（覃海寧等，2017）。

遺傳多樣性代表著物種適應(yīng)能力與進(jìn)化潛力，使其適應(yīng)環(huán)境的改變（Frankhametal.，2002）。對(duì)珍稀瀕危植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究不僅能了解導(dǎo)致物種瀕危的機(jī)制，還可以為其保護(hù)策略與管理方式的制定提供理論基礎(chǔ)（Segarra-Moraguesetal.，2005;Suetal.，2017）。利用分子標(biāo)記的方法估算遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)已成為保護(hù)瀕危物種的常用方法（Ryall，1998）。微衛(wèi)星（Microsatellites）標(biāo)記也叫簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeats，SSRs），具有高多態(tài)性、共顯性、穩(wěn)定性及重復(fù)性好和在真核生物中廣泛存在等優(yōu)點(diǎn)，是研究物種種群遺傳學(xué)的一種有效工具（Lietal.，2013;Gyrgyetal.，2014;Mengetal.，2015）。微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛應(yīng)用于揭示瀕危植物種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)（Yangetal.，2016;Maetal.，2015;Zhaoetal.，2017;Heetal.，2017）。

遺傳多樣性分析是評(píng)價(jià)和保護(hù)瀕危植物的重要指標(biāo)，它能為瀕危植物制定有效的保護(hù)措施提供重要依據(jù)（Ciresetal.，2011）。關(guān)于薄葉金花茶、小花金花茶和小瓣金花茶遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估三種金花茶7個(gè)種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，旨在了解他們的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，依據(jù)研究結(jié)果提出保護(hù)策略。

1材料與方法

1.1材料

薄葉金花茶和小花金花茶在分類上沒(méi)有分歧（張宏達(dá)和任善湘，1998;Ming&Bartholomew，2007），Ming&Bartholomew（2007）將小瓣金花茶歸并到檸檬金花茶（Camelliaindochinensis），但是小瓣金花茶和檸檬金花茶在形態(tài)上存在一定的差異，因此，本研究仍按照張宏達(dá)和任善湘（1998）把小瓣金花茶作為獨(dú)立的種進(jìn)行采樣。我們?cè)谡麄€(gè)分布區(qū)內(nèi)共找到7個(gè)種群，3個(gè)小花金花茶種群和2個(gè)小瓣金花茶種群的分布及形態(tài)特征與原描述相符。種群BH1和BH2觀察到的花直徑最大只有3cm，與《中國(guó)植物志》（張宏達(dá)和任善湘，1998）描述的薄葉金花茶花的直徑4～5.5cm不相符。但薄葉金花茶模式標(biāo)本無(wú)花有果，新種發(fā)表時(shí)沒(méi)有花的描述（張宏達(dá)，1979），花直徑4～5.5cm是根據(jù)其他標(biāo)本的花進(jìn)行描述（葉泉清和薛躍規(guī)，2013）;BH2種群是南寧金花茶公園基因庫(kù)的薄葉金花茶的引種地，種群BH1的分布地是薄葉金花茶模式標(biāo)本的采集地龍州大青山，因此我們?nèi)哉J(rèn)定這兩個(gè)種群為薄葉金花茶。每株植物選取2～3片新鮮的嫩葉放入有變色硅膠的封口袋中干燥后，用于總DNA的提取。材料來(lái)源、憑證標(biāo)本信息等詳見(jiàn)表1，種群分布地見(jiàn)圖1。憑證標(biāo)本存放于廣西植物標(biāo)本館（IBK）。

1.2DNA提取和SSR分型

采用改良的CTAB法（Doyle，1987）提取葉片總DNA。從Luetal.（2014）和Liufuetal.（2014）為平果金花茶和淡黃金花茶開(kāi)發(fā)的共59對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選出11對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星引物用于本研究。PCR擴(kuò)增體系和程序參考Liufuetal.（2014）描述的方案。

1.3數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)利用Genepopversion4.1（Rousset，2008）檢測(cè)哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE），并對(duì)所得P值進(jìn)行sequentialBonferroni校正（Rice，1989）。GenALEx6.5（Peakall&Smouse，2012）軟件用于統(tǒng)計(jì)平均等位基因數(shù)（NA）、有效等位基因數(shù)（NE）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、固定系數(shù)（F）和多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPB）等多樣性指數(shù)。分子變異方差分析AMOVA（Analysisofmolecularvariance）（Excoffieretal.，1992）利用Arlequin3.0（Excoffieretal.，2005）軟件計(jì)算，并用該軟件統(tǒng)計(jì)種間和種群間分化系數(shù)FST?；蛄鳎∟m）估算利用公式Nm=（1-FST）/4FST。

遺傳差異的主成分分析（PCoA）利用GenALEx6.5軟件計(jì)算。STRUCTURE2.3（Pritchardetal.，2000）對(duì)7個(gè)種群進(jìn)行分析，根據(jù)遺傳成分的差異來(lái)分析種群遺傳結(jié)構(gòu)。參數(shù)設(shè)置為K=1-6，每個(gè)K值分別運(yùn)行20次，Burn-in105次，MarkovChainMonteCarlo（MCMC）5×105迭代。運(yùn)行結(jié)果利用在線軟件STRUCTUREHARVESTER

（Earl&Vonholdt，2012）分析，計(jì)算出最佳遺傳學(xué)組數(shù)K。利用GenALEx6.5中的Manteltest檢測(cè)7個(gè)種群的遺傳距離是否與地理距離（isolationbydistance，IBD）存在相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1種群遺傳多樣性

11個(gè)位點(diǎn)在三種金花茶184個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到等位基因92個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)8.364個(gè)（表2）。7個(gè)種群11個(gè)位點(diǎn)共77次Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果共有9次偏離平衡（P<0.05），經(jīng)sequentialBonferroni校正后，只有位點(diǎn)TER8在種群NB3偏離平衡。所有數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

各種群遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。在物種水平上，小瓣金花茶平均等位基因數(shù)（NA）、有效等位基因數(shù)（NE）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）分別是3.9、2.328、0.520、0.501，高于薄葉金花茶和小花金花茶。在種群水平上，7個(gè)種群平均等位基因數(shù)（NA）在2.7（NB1）～5.1（NB3）之間，平均值為3.8。有效等位基因數(shù)（NE）在1.788（NB1）～2.466（PT1）之間，平均值為2.161。觀測(cè)雜合度（Ho）在0.409（NB1）～0.543（NB3）之間，平均值為0.487。期望雜合度（He）在0.379～0.543之間，平均值為0.471，最高在種群NB3，最低在種群NB1（表3）。

2.2遺傳結(jié)構(gòu)

分子變異方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示，三種金花茶種間變異占9.66%，種內(nèi)種群間變異占24.62%，種群內(nèi)變異占65.72%（表4）。在種內(nèi)，他們的分子變異大部分都存在于種群內(nèi)部，薄葉金花茶種群間變異占24.41%，種群內(nèi)變異占75.59%;小花金花茶種群間變異占18.20%，種群內(nèi)變異占81.80%;小瓣金花茶種群間變異占35.39%，種群內(nèi)變異占64.61%。兩種群間的遺傳分化系數(shù)FST和基因流Nm如表5所示，F(xiàn)ST在0.1437～0.4533之間，其中1組種群間FST值小于0.15;6組種群間FST值在0.15～0.25之間，14組種群間FST值大于0.25，說(shuō)明種群間分化大。Nm在0.3015～1.4889之間，僅有3組種群間基因流大于1，種群間基因流較低。薄葉金花茶和小花金花茶種間分化系數(shù)FST為0.1731，薄葉金花茶和小瓣金花茶種間分化系數(shù)FST為0.2583，小花金花茶和小瓣金花茶種間分化系數(shù)FST為0.2068，薄葉金花茶與小花金花茶分化較小，小瓣金花茶與其他兩種金花茶分化較大。

STRUCTURE和PCoA分析三種金花茶遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果基本一致。STRUCTURE分析結(jié)果顯示，7個(gè)種群184個(gè)個(gè)體最佳遺傳學(xué)分組K=2（圖2），此時(shí)薄葉金花茶的2個(gè)種群和小花金花茶的3個(gè)種群大部分個(gè)體分為一組，小瓣金花茶2個(gè)種群的大部分個(gè)體分為一組（圖3）。PCoA分析結(jié)果（圖4），7個(gè)種群所有個(gè)體分為兩組，即薄葉金花茶的2個(gè)種群和小花金花茶的3個(gè)種群分為一組，小瓣金花茶2個(gè)種群分為一組，但是小瓣金花茶兩個(gè)種群明顯分開(kāi)，其中種群PT1更接近于小花

金花茶的3個(gè)種群。Coord.1和Coord.2分別代表18.76%和12.59%的總變異。Manteltest結(jié)果表明7個(gè)種群間地理距離和遺傳距離呈弱的正相關(guān)性但不顯著（R2=0.0847，P=0.23）（圖5）。

3討論

3.1遺傳多樣性

遺傳多樣性水平是決定種群適應(yīng)進(jìn)化潛力的重要因素（Frankhametal.，2002）。一般來(lái)說(shuō)，特有植物、珍稀瀕危植物以及小而孤立的種群具有較低水平的遺傳多樣性（Spielmanetal.，2004;

Gaoetal.，2017）。與同屬植物相比，三種金花茶的平均等位基因數(shù)NA和期望雜合度He較低（薄葉金花茶，NA=3.7，He=0.431;小花金花茶，NA=3.8，He=0.476;小瓣金花茶，NA=3.9，He=0.501），低于同屬植物淡黃金花茶[C.flavida，A（等位基因數(shù)）=4.4，He=0.555]（盧永彬，2015），大理茶[C.taliensis，AR（等位基因豐富度）=6.776，Hs（基因多樣性）=0.597]（Zhaoetal.，2014），還低于山茶（C.japonica，A=16.5，He=0.84）（Uenoetal.，2000）和茶（C.sinensis，A=4.3，He=0.64）（Yaoetal.，2012）。因此，三種金花茶均檢測(cè)到相對(duì)較低水平的遺傳多樣性。影響物種遺傳多樣性的因素有多種，如生存環(huán)境、地理分布和繁殖方式等（Nybom，2004）。三種金花茶分布地非常狹窄，并且人們對(duì)他們野生植株的移植和對(duì)土地的開(kāi)發(fā)利用，導(dǎo)致他們的野生種群大小下降，并呈片斷化分布，所有種群的實(shí)際種群個(gè)體數(shù)都少于100。分布地狹窄、種群小和片斷化分布可能導(dǎo)致了三種金花茶種群遺傳多樣性水平低。

3.2遺傳結(jié)構(gòu)

三種金花茶種群間存在高水平的遺傳分化（表5），其中，遺傳分化系數(shù)FST僅在種群NB1和NB2之間小于0.15，存在中等程度的遺傳分化，其他種群之間存在較大（0.15<6組種群間FST值<0.25）或者很大的遺傳分化（14組種群間FST值>0.25）（Wright，1968）。種內(nèi)種群間FST在薄葉金花茶（0.2441）和小花金花茶（0.1437，0.2555和0.1612）呈較大的遺傳分化，小瓣金花茶種內(nèi)種群間FST呈很大的遺傳分化（0.3514），大于大部分的種內(nèi)種群間遺傳分化值，可能是因?yàn)樾“杲鸹ú璺N群PT2是被長(zhǎng)期孤立的小種群而形成的。這種很大的遺傳分化結(jié)果在同屬近緣種植物淡黃金花茶中也檢測(cè)到（盧永彬，2015）。影響種群遺傳分化的因素有多種，其中基因流是影響種群遺傳分化的重要因素之一（陳小勇，2000）。7個(gè)種群間基因流Nm較?。ū?），僅有3組種群間的Nm大于1，根據(jù)Wright（1931）理論，只有當(dāng)種群間Nm>1時(shí)，基因流才能抵制遺傳漂變的作用，并防止遺傳漂變導(dǎo)致的種群間遺傳分化的發(fā)生?；ǚ鄣臄U(kuò)散和種子的傳播是植物基因主要的兩種交流形式。在同屬植物的研究中，淡黃金花茶（Weietal.，2017;彭國(guó)清和唐紹清，2017）、油茶（鄧園藝等，2010）和大理茶（Liuetal.，2012）的種子或花粉傳播能力有限，導(dǎo)致了種群間具有較少的基因流，并產(chǎn)生遺傳分化。三種金花茶種群呈片斷化分布，限制了花粉和種子在種群間的擴(kuò)散，導(dǎo)致種群間存在較低水平的基因流，他們的野生種群小且孤立，受遺傳漂變的影響較大。種群片斷化分布、有限的傳播能力、種群小和遺傳漂變的影響，可能導(dǎo)致了三種金花茶高水平種群間遺傳分化。

STRUCTURE和PCoA分析結(jié)果類似，取樣種群最佳遺傳學(xué)分組數(shù)為2，即薄葉金花茶和小花金花茶大部分個(gè)體分為一組，小瓣金花茶大部分個(gè)體分為一組，與這三種金花茶地理分布區(qū)域一致，說(shuō)明薄葉金花茶與小花金花茶之間分化較小，小瓣金花茶與其他兩種金花茶分化較大。表明薄葉金花茶的2個(gè)取樣種群和小花金花茶的3個(gè)代表種群很可能是同一種植物。

3.3保護(hù)生物學(xué)意義

物種遺傳多樣性水平與其生存能力和適應(yīng)能力密切相關(guān)（Hamrick&Godt，1996）。本研究表明三種金花茶具有較低水平的遺傳多樣性和高水平的種群間遺傳分化。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)取樣種群的生境都已遭到不同程度的破壞，如種群PT2分布地已被開(kāi)發(fā)用來(lái)種植八角樹(shù);種群BH1分布地已被開(kāi)發(fā)用來(lái)種植桉樹(shù);種群BH2分布地計(jì)劃要修建公路，如果計(jì)劃實(shí)施，公路將橫穿BH2種群分布地，導(dǎo)致大部分植株被挖掉。因此，現(xiàn)存的所有種群應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況盡快采取就地保護(hù)或遷地保護(hù)措施，實(shí)施遷地保護(hù)措施時(shí)，每個(gè)種群都應(yīng)選取代表性個(gè)體遷入種質(zhì)資源庫(kù)保護(hù)其種質(zhì)資源。

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