劉潮 褚洪龍 韓利紅 楊云錦 高永 唐利洲

摘要：利用生物信息學(xué)方法，全面分析了桑樹NBS-LRR類基因家族組成、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、組織表達(dá)，并對該家族基因的調(diào)控microRNA（ miRNA）進(jìn)行了預(yù)測。共篩選到112個(gè)桑樹NBS-LRR類基因，根據(jù)功能域主要分為NBS、CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR 4種類型。內(nèi)含子數(shù)和相位分析結(jié)果顯示，基因結(jié)構(gòu)類型多樣。聚類分析結(jié)果顯示不同聚類組間存在較多的類型交叉現(xiàn)象。該家族基因存在組織表達(dá)特異性。大部分桑樹NBS-LRR類基因均具有被miRNAs調(diào)控的可能性，miR472b和miR482b在調(diào)控該家族基因表達(dá)中可能發(fā)揮了主要作用。桑樹NBS-LRR家族基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的復(fù)雜性決定了其功能的多樣性，miRNA在控制該家族基因表達(dá)的適應(yīng)性成本中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 桑樹;NBS-LRR;生物信息學(xué);miRNA

中圖分類號： S792.99

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0544-10

植物在與病原的長期協(xié)同進(jìn)化過程中，發(fā)展出了一整套高度復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，以識別并對抗病原的侵襲。植物先天免疫系統(tǒng)包括2層防御系統(tǒng)：第1層是植物通過細(xì)胞表面的模式識別受體（ Patternrecognition receptors，PRRs）對保守的病原/微生物相關(guān)分子模式（ Pathogen/microbe associated molecularpattern，P/MAMP）的識別，稱為病原相關(guān)分子模式引發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）[1-3];第2層的免疫一般發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，主要依靠抗性基因（ Re-sistance gene）編碼的多態(tài)性抗病蛋白識別無毒因子而實(shí)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)多數(shù)是胞內(nèi)富含亮氨酸重復(fù)序列和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)蛋白（ Nucleotide binding site andleucine-rich repeat proteins， NBS-LRR proteins），能直接或間接識別病原特異性效應(yīng)蛋白，而激發(fā)相似的防御反應(yīng)，稱為效應(yīng)子引發(fā)的免疫（Effector-triggeredimmunity，ETI）[1]。與PRRs相比，R蛋白在進(jìn)化上出現(xiàn)相對較晚，在與病原互作中持續(xù)出現(xiàn)了大量新成員。典型的NBS-LRR類基因編碼的蛋白質(zhì)具有一些共同的結(jié)構(gòu)域：位于中心區(qū)的NBS結(jié)構(gòu)域、C端的LRR結(jié)構(gòu)域、N端與Toll/白細(xì)胞介素受體（Toll-inter-leukin-l receptor，TIR）同源的結(jié)構(gòu)域或卷曲螺旋（ Coiled coil，CC）結(jié)構(gòu)域。其中中心區(qū)的NBS作為一個(gè)信號轉(zhuǎn)換器，通過與ADP或ATP的結(jié)合而改變蛋白質(zhì)的鈍化或激活狀態(tài)，使信號關(guān)閉或開放;C端的LRR結(jié)構(gòu)域是植物R蛋白中最具多態(tài)性的部分，與其識別效應(yīng)子的特異性相關(guān)[4];N端的CC或TIR結(jié)構(gòu)域則在下游信號的激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。NB-ARC結(jié)構(gòu)域是在細(xì)菌和真核生物中發(fā)現(xiàn)的信號基序，存在于植物抗病基因和動(dòng)物細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因中[7]，這一結(jié)構(gòu)域無論是在植物還是動(dòng)物的NBS-LRR蛋白中都十分保守[4]，并成為克隆各種作物抗病基因類似物（ Resistance gene analogs，RGAs）的NBS區(qū)域重要的序列依據(jù)。

有研究結(jié)果表明，小RNA在植物的先天免疫中發(fā)揮作用[8]。植物抗病基因存在適應(yīng)性成本，NBS-LRR的高表達(dá)對植物的生長是不利的[9]。MicroRNA是一類21 nt的小分子RNA.miRNA通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控NBS-LRR類基因的表達(dá)[1O-11]。在進(jìn)化上，NBS-LRR類基因與其調(diào)控的miRNA在基因組水平上保持動(dòng)態(tài)平衡，從而控制了NBS-LRR的潛在適應(yīng)性成本[12]。同一家族miRNA往往有靶向保守區(qū)域，因此一個(gè)miRNA可靶向多個(gè)NBS-LRR類基因[13-14]。

川桑（Morus notabilis）是?？粕俾淙~喬木，分布于中國中部和北部各省。桑葉養(yǎng)蠶在中國有著悠久的歷史，是中國絲綢文化的基礎(chǔ)。桑樹木材可用于制作器具，樹皮可作為造紙?jiān)?，桑椹可供食用、釀酒。田間栽培中，經(jīng)常出現(xiàn)桑萎縮病、疫病、褐斑病、赤銹病和青枯病等多種病害，往往造成植株發(fā)育不良、桑葉產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣等問題，嚴(yán)重影響蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，隨著川?；蚪M數(shù)據(jù)的公布[15]，大量桑樹抗病基因的研究結(jié)果先后發(fā)表[16-19]，然而關(guān)于桑樹NBS-LRR家族基因的研究鮮見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法對桑樹基因組中NBS-LRR類基因進(jìn)行鑒定，并分析該家族基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、組織表達(dá)及其調(diào)控miRNA特征，為NBS-LRR類基因功能的揭示和開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 桑樹NBS-LRR類基因的獲取

以擬南芥NBS-LRR類基因序列為查詢序列，搜索桑樹基因組數(shù)據(jù)庫（ https：//morus. swu. edu. cn/morusdb/），下載桑樹NBS-LRR類基因序列。

1.2 桑樹NBS-LRR類基因的鑒定與分類

通過GenBank數(shù)據(jù)庫在線工具CDD（ https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。使用Pfam（ http：//pfam. xfam. org/）和COILS Server（http：//www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html）對候選NBS-LRR類基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確認(rèn)，包括NBS、TIR、LRR、CC等，排除不含NBS結(jié)構(gòu)域的基因。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域類型，將NBS-LRR類基因進(jìn)行分類。

1.3 桑樹NBS-LRR類基因和編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

所有桑樹NBS-LRR類基因堿基序列和編碼的氨基酸序列均從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫下載。使用GSDS在線軟件（ http：//gsds. cbi. pku. edu. cn/index. php）繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。通過MEME SUITE在線工具（ht-tp：//meme-suite. org/tools/meme）預(yù)測桑樹NBS-LRR蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守Motif，參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

1.4 桑樹NBS-LRR蛋白氨基酸序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

對所有蛋白質(zhì)使用ClustalX進(jìn)行氨基酸序列比對。應(yīng)用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 桑樹NBS-LRR類基因表達(dá)分析

通過桑樹基因組數(shù)據(jù)庫下載獲得候選NBS-LRR類基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別對其在根、樹皮、冬芽、雄花和葉中表達(dá)進(jìn)行分析。

1.6 miRNA靶標(biāo)NBS-LRR類基因預(yù)測

根據(jù)序列互補(bǔ)原則對NBS-LRR類基因的調(diào)控miRNA進(jìn)行預(yù)測。使用psRNATarget在線軟件（ht-tp：//plantgrn. noble. org/psRNATarget/）對文獻(xiàn)中111個(gè)桑樹miRNA[ 20-21]的靶標(biāo)NBS-LRR類基因進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹NBS-LRR類基因的鑒定與分類

通過搜索桑樹基因組數(shù)據(jù)庫，共獲得含有NBS核心結(jié)構(gòu)的桑樹NBS-LRR類候選基因112個(gè)，占桑樹基因組總基因數(shù)（29 261個(gè)）的0.4%，其中編碼的蛋白質(zhì)具有NBS、LRR和CC完整結(jié)構(gòu)域的基因共33個(gè)，占NBS-LRR類基因的29.5%（表1）。編碼的蛋白質(zhì)含有LRR結(jié)構(gòu)域的有63個(gè)，不含LRR結(jié)構(gòu)域的基因有49個(gè)。桑樹NBS-LRR類基因比例與擬南芥比較接近，而明顯少于其他一些物種[12];物種間NBS-IRR類基因數(shù)量存在較大差異，這可能與植物在進(jìn)化過程中NBS-IRR類基因經(jīng)受的選擇壓力有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，桑樹NBS-LRR類基因主要分為NBS、CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR4種結(jié)構(gòu)類型。除了具有NBS、TIR、LRR、CC結(jié)構(gòu)域之外，還包含DUF、P-loop、zf-RVT和RPW8等結(jié)構(gòu)域類型。發(fā)現(xiàn)L848_014445、L848_013225、L848_013226含有RPW8結(jié)構(gòu)域，RPW8為擬南芥白粉病廣譜抗性蛋白家族功能域，這些基因可能與植物的白粉病抗性有關(guān)。功能注釋分析結(jié)果顯示，編碼抗病蛋白RPM1基因34個(gè)，編碼抗病蛋白RGA基因24個(gè)，編碼抗病蛋白RPP13基因12個(gè)，此外還有非活性疾病易感蛋白LOVI、晚疫抗性蛋白、TMV抗性蛋白N等。

2.2 桑樹NBS-LRR類基因結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)對桑樹NBS-LRR類基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該家族基因結(jié)構(gòu)類型多樣。大部分CC-NBS-LRR類型基因只含有1個(gè)外顯子，編碼序列長度一致性較高，而NBS類型基因內(nèi)含子數(shù)和內(nèi)含子相位類型較復(fù)雜，編碼序列長度差異較大（圖1）。

使用MEME在線軟件對桑樹NBS-LRR蛋白質(zhì)基序進(jìn)行分析（表2）。Motif 1位于NBS功能域N末端，也是AAA功能域（ATPases associated witha variety of cellular activities）的一部分，參與膜融合、蛋白質(zhì)水解和DNA復(fù)制等多種細(xì)胞過程;Motif 2- Motif 5和Motif 10位于NBS功能域中間部分，也是AAA功能域的組成部分;Motif 7位于NBS功能域的C端，大部分桑樹NBS-LRR蛋白均含有這些Motif，也有少部分桑樹缺少該類Moti;Motif 6位于LRR功能域內(nèi)，也是SCOP dlfqva2功能域的一部分，屬于RNI-like超家族，由相似重復(fù)構(gòu)成的規(guī)則結(jié)構(gòu)，形成右手盧-a超螺旋的LRR功能域，NBS-LRR蛋白質(zhì)中含有O至多個(gè)Motif 6，最多的IA84_025528蛋白質(zhì)含有8個(gè);Motif 8和Motif 9分別位于CC結(jié)構(gòu)的N端和中部，在下游信號的激活中發(fā)揮作用，CC-NBS和CC-NBS-LRR類蛋白質(zhì)含有至少1個(gè)該類Motif。

去掉部分相似度較低的序列，選擇92個(gè)桑樹NBS-LRR類基因構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，對基因進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果（圖2）顯示，桑樹NBS-LRR類基因主要分為4個(gè)大的聚類組，4種主要NBS-LRR類基因聚類存在交叉現(xiàn)象，部分CC-NBS和NBS-LRR類基因聚類到CC-NBS-LRR組中，部分CC-NBS-LRR和NBS類基因聚到CC-NBS組中，部分NBS、CC-NBS-LRR和CC-NBS類基因聚到NBS-LRR組中，NBS組中含有多個(gè)其他3種基因類型成員。說明進(jìn)化過程中不同類型的NBS-LRR類基因間可能存在遺傳信息的交換或共進(jìn)化現(xiàn)象。每個(gè)小聚類組中，NBS類型基因的進(jìn)化枝長要短于同組其他類型基因，表明該組基因可能來源于該NBS類型基因。

2.3 桑樹NBS-LRR類基因的組織表達(dá)

為了解桑樹NBS-LRR類基因的組織表達(dá)特征，下載并分析了桑樹基因組數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。共檢測到93個(gè)基因在不同組織中有表達(dá)（圖3）。其中基因L484_013225和L484_ 014445在所有檢測組織中均有較高表達(dá)，這2個(gè)基因均含有RPW8結(jié)構(gòu)域，屬于RPW8-NBS-LRR結(jié)構(gòu)域類型，可能在桑樹基礎(chǔ)抗病中發(fā)揮主要作用。L484一022383、L484一013226、L484_017039、LA84_ 025528、LA84一018436、LA84_017010、LA84一010201等基因在樹枝樹皮、雄花和葉中表達(dá)量較高，而在根（除L484一022383和LA84_ 013226外）和冬芽中表達(dá)量稍低?；騆484一013672僅在根和樹枝樹皮中檢測到較高表達(dá)。部分基因僅在特定組織中檢測到較低表達(dá)。總體而言，較多的NBS-LRR類基因在樹枝樹皮、雄花和葉等組織中表達(dá)值較高，其次是根，而冬芽中多數(shù)NBS-LRR類基因的表達(dá)較低或未檢測到表達(dá)。說明不同的NBS-LRR類基因在桑樹的不同組織中發(fā)揮作用，部分基因存在組織表達(dá)特異性。

2.4 miRNA對NBS-LRR類基因的調(diào)控分析

根據(jù)序列互補(bǔ)原則，利用psRNATarget在線軟件對桑樹miRNA與NBS-LRR類基因的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行序列比對分析，篩選到614個(gè)miRNA與NBS-LRR類基因存在調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)101個(gè)桑樹miRNA可調(diào)控106個(gè)NBS-LRR類基因。較低的期望值表示miRNA與靶基因序列匹配較好。非配對靶標(biāo)位點(diǎn)最大能量（ UPE）為解開靶基因mRNA靶位點(diǎn)二級結(jié)構(gòu)所需的能量，較低的UPE值表示miRNA結(jié)合或裂解靶基因的可能性較高。本研究選擇期望值小于3的部分比對結(jié)果進(jìn)行展示（表3）。miR472b和miR482b可對多個(gè)NBS-LRR類基因靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，LA84一022259同時(shí)被miR472b和miR482a-3p

2個(gè)miRNA識別。miRNA對靶標(biāo)NBS-LRR類基因的調(diào)控有轉(zhuǎn)錄抑制和序列裂解2種方式，這2種抑制基因表達(dá)的方式比例相當(dāng)，但不同類型miRNA的調(diào)控方式不同，miR472b可通過轉(zhuǎn)錄抑制和裂解2種方式調(diào)控不同靶基因的表達(dá)，miR482主要通過轉(zhuǎn)錄抑制方式調(diào)控靶基因表達(dá)（表3）。

3 討論

植物NBS-LRRS存在群體水平上的多態(tài)性，其在直系同源基因的序列組成和旁系同源基因的總體數(shù)量上都有差異，宿主中NBS-LRRS基因的數(shù)量與物種病原效應(yīng)子的多態(tài)性有關(guān)[22]。自1994年第一個(gè)NBS-LRR類基因被成功克隆后[23]，大量NBS-LRR類基因陸續(xù)被研究和報(bào)道，研究集中在NBS-LRR類基因的多樣性及進(jìn)化上[24]。本研究通過搜索桑樹基因組數(shù)據(jù)庫，共獲得112個(gè)具有NBS核心結(jié)構(gòu)域的桑樹NBS-LRR類候選基因，其中63個(gè)同時(shí)具有NBS和LRR功能域。NBS結(jié)構(gòu)域參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有高度保守和序列一致的基序，而LRR結(jié)構(gòu)域參與病原體配體的識別，通常是高度可變的[25]。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，桑樹NBS-LRR類基因聚類存在類型間的交叉，成員較少的聚類組中基因類型一致性較高，而成員較多的聚類組中往往有多個(gè)類型的基因。聚類組中類型和結(jié)構(gòu)一致的基因可能是由共同的NBS-LRR類祖先基因復(fù)制而來，而同一聚類組中不同類型的基因可能是由異位重組而來，異位重組導(dǎo)致該聚類組基因的擴(kuò)張[24]。有些抗病基因需要2個(gè)NBS-LRR類基因共同介導(dǎo)，例如水稻中Pikml TS和Pikm2 TS共同介導(dǎo)抗病基因Pikm[26] ，RRS1和RPS4在十字花科植物多種細(xì)菌性病害抗性中共同發(fā)揮作用[27]。這可能與NBS-LRR類基因的適應(yīng)性成本有關(guān)，也是該家族基因進(jìn)化復(fù)雜性的體現(xiàn)。

多個(gè)NBS-LRR類基因被鑒定為廣譜抗性基因，過表達(dá)NBS-LRR類基因，顯著增強(qiáng)了植物的抗病性[28]。本研究中，NBS-LRR類基因的組織表達(dá)存在差異，基因L484一013225和IA84一014445在多個(gè)組織中均有較高表達(dá)，這2個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均含有白粉病抗性蛋白功能域RPW8，可能在桑樹的基礎(chǔ)抗病中起作用，而L484一022383等基因在部分組織中表達(dá)較高，可能在桑樹的特定組織器官或特定時(shí)期生長發(fā)育或抗病中發(fā)揮作用，也有些基因組織表達(dá)水平較低或未檢測到表達(dá)，這些基因可能參與植物特定時(shí)期的抗病過程或者處于非激活狀態(tài)。

miRNA作為調(diào)節(jié)子在NBS-LRR類基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用[24]。植物NBS-LRR類基因的高表達(dá)導(dǎo)致能量損耗而影響植物生長，植物進(jìn)化出miR-NA-NBS-LRR系統(tǒng)來調(diào)控NBS-LRR的表達(dá)[12]。Lu等[29]首次報(bào)道了miRNA對NBS-LRR類基因的調(diào)控，隨后大量miNRA與其靶NBS-LRR類基因的作用關(guān)系被明確[8]。番茄miR482通過靶NBS-IRR受體的P-loop，與168個(gè)抗性基因中的58個(gè)發(fā)生作用30]。在番茄、馬鈴薯和煙草中至少搜索到10個(gè)miRNA家族及其靶抗性基因之間的作用關(guān)系，說明miRNA調(diào)節(jié)抗性基因表達(dá)在植物基因組中普遍存在[31]。通過對桑樹miRNA與NBS-LRR類基因調(diào)控關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)大部分桑樹NBS-LRR類基因均具有被miRNA調(diào)控的潛在可能，有17個(gè)miRNA與靶標(biāo)序列匹配期望值小于3，其中miR472b和miR482b均有5個(gè)靶NBS-LRR預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)，這些miRNA在桑樹生長發(fā)育和抗病中的調(diào)控作用值得進(jìn)一步深入研究。

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