吳勤勤　蘇敏

摘? ?要：隨著脂肪酶在我們生產(chǎn)生活中的廣泛應(yīng)用，人們?cè)絹?lái)越多地使用生物技術(shù)手段對(duì)酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以改善不同來(lái)源脂肪酶的性質(zhì)，獲得更多滿足人類需求的脂肪酶。氧陰離子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，因此，在脂肪酶的催化反應(yīng)過(guò)程中，氧陰離子洞結(jié)構(gòu)發(fā)揮著很重要的作用，也為此成為研究的熱點(diǎn)。在過(guò)去的十多年里，人們更加關(guān)注對(duì)脂肪酶氧陰離子洞的研究并且取得了很大的進(jìn)展，對(duì)此進(jìn)行了研究和闡述。

關(guān)鍵詞：脂肪酶;氧隱離子洞;催化元件

1? ? 脂肪酶及氧陰離子洞簡(jiǎn)介

脂肪酶（EC 3.1.1.3） 又稱三酯酰甘油?；饷?，是在油水界面中最具有活性的丙三醇酯水解酶。它們不僅能夠催化水解反應(yīng)還能催化長(zhǎng)鏈酰基甘油的合成，在食品加工、洗滌、制藥、化工等領(lǐng)域都被廣泛的應(yīng)用[1]。脂肪酶廣泛存在于自然界中，但是從自然界中直接分離純化得到的酶往往不能滿足生活、工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室改造獲得高性能、強(qiáng)實(shí)用性的脂肪酶，已成為一種有效的途徑。雖然不同脂肪酶的來(lái)源不同，并且它們的氨基酸序列也大不相同，但它們?nèi)匀挥幸恍┫嗤慕Y(jié)構(gòu)。如都具有一個(gè)含有催化三連體（Ser-His-Asp/Glu）的催化中心[2];都具有一個(gè)特殊的序列-G X1 S X2 G-[3];都具有α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)并且在一些其他的水解酶中它們的3-D折疊結(jié)構(gòu)是相同的[4]。在脂肪酶未活化（處于水相或者有機(jī)相）時(shí)，其催化中心會(huì)被一個(gè)靈活的“蓋子”蓋住，阻止了底物與酶的活性中心接觸。在油-水界面上時(shí)，脂肪酶存在一種“界面激活”的現(xiàn)象。即在油-水界面處，脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)區(qū)域的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，從而使蓋子結(jié)構(gòu)被打開，活性中心暴露出來(lái)，底物順利進(jìn)入活性中心并與之結(jié)合，使脂肪酶的催化活性大幅度提升。當(dāng)“蓋子”打開的同時(shí)，氧陰離子洞也隨之形成。氧陰離子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，由催化三連體中絲氨酸的側(cè)鏈或兩個(gè)主鏈酰胺基團(tuán)組成[5]，在大多數(shù)情況下由來(lái)自兩個(gè)主鏈酰胺結(jié)合羰基氧形成的氫鍵來(lái)穩(wěn)定四面體中間產(chǎn)物[6]。根據(jù)氧陰離子洞的氨基酸組成，脂肪酶被分為3大類：GGG（X）- ，G（X）- 和Y-類[7]。依據(jù)一般分類，G（X）類由11個(gè)超家族和22個(gè)同源家族組成，其中包含376個(gè)蛋白質(zhì)，具有6 004個(gè)序列和已知結(jié)構(gòu)的125條鏈。該類主要包括細(xì)菌和真菌脂肪酶、真核脂肪酶、角質(zhì)酶、磷脂酶和非血紅素過(guò)氧化物酶。GGG（X）類由5個(gè)超家族和16個(gè)同源家族組成，包括430個(gè)蛋白質(zhì)，具有767個(gè)序列和73個(gè)已知結(jié)構(gòu)的鏈。它包括細(xì)菌酯酶、真核羧酸酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰膽堿酯酶和硫酯酶等?！澳蠘O假絲酵母脂肪酶A”超家族，由于構(gòu)成CAL-A氧陰離子洞氨基酸殘基為Tyr93，因此被分為Y型。它包含一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)，CAL-A和39個(gè)序列分配給32種蛋白質(zhì)，它們都來(lái)自屬于真菌界的微生物。

酶的催化活性除受外界環(huán)境（溫度、pH、鹽離子等）影響外，其自身的活性中心、“蓋子”結(jié)構(gòu)、?；诖?、氧陰離子洞等結(jié)構(gòu)也都會(huì)影響酶對(duì)底物的催化能力[8]。因此，氧陰離子洞作為影響酶活性的重要因素被人們關(guān)注。研究學(xué)者在對(duì)酶性質(zhì)研究的過(guò)程中，不僅改變脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)的組成、鉸鏈區(qū)的氨基酸種類和?；诖拇笮?，還改變組成脂肪酶氧陰離子洞的氨基酸殘基。對(duì)組成脂肪酶氧陰離子洞氨基酸殘基的改造旨在得到符合人們要求的脂肪酶突變體，并將該突變體在食品、制藥、化工、洗滌劑等工業(yè)方面加以應(yīng)用。

2? ? 脂肪酶氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的組成及改造研究

2.1? 關(guān)于脂肪酶氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的組成

氧陰離子洞作為影響脂肪酶催化活性的重要結(jié)構(gòu)，成為人們研究的熱點(diǎn)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，改變氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的氨基酸的組成，或者改變氧陰離子洞的類型，會(huì)對(duì)脂肪酶的底物特異性、熱穩(wěn)定性和催化活性等產(chǎn)生重大影響。人們對(duì)脂肪酶分子中氧陰離子洞結(jié)構(gòu)組成的判斷，主要通過(guò)基因序列分析、X-射線晶體衍射技術(shù)、同源建模、酶活性中心分析等方法。如通過(guò)X-射線晶體衍射技術(shù)和酶活性中心分析得出法德氏根霉脂肪酶和雪白根霉脂肪酶的氧陰離子洞都可能由羥基和主鏈上的Thr 83所構(gòu)成[9]。Seizaburo Shiraga等[10]通過(guò)晶體分析得知，米根霉脂肪酶的氧陰離子洞可能由Thr 93 和Asp 94構(gòu)成。MaevaSubileau等[11]通過(guò)同源建模并對(duì)此加以分析得出G181和D90可能是構(gòu)成平滑假絲酵母脂肪酶A（CAL-A）氧陰離子洞的氨基酸殘基。

2.2? 脂肪酶氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的改造

氧陰離子洞結(jié)構(gòu)在酶的催化過(guò)程中具有重要的價(jià)值。近年來(lái)，隨著脂肪酶在生活中被廣泛應(yīng)用，并且為了得到具有耐低溫、耐高溫、具有立體選擇性等特性的酶，人們對(duì)酶蛋白氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的改造研究日趨升溫。研究學(xué)者對(duì)酶結(jié)構(gòu)的改造策略常有理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要用理性設(shè)計(jì)這種方法對(duì)氧陰離子洞（oxyanion hole）進(jìn)行改造。理性設(shè)計(jì)分為定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和誘變，是經(jīng)常用于改造氧陰離子洞結(jié)構(gòu)的一種方法[12-14]，其原理是依據(jù)脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)，利用生物信息學(xué)分析酶蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，然后運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)完成氨基酸殘基的替換[15]。

2.2.1? 定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變是較早用于改造脂肪酶的分子生物學(xué)手段。目前，人們?nèi)岳迷撌侄卧诿阜肿拥姆€(wěn)定性、催化活性等方面進(jìn)行成功的改造。為了研究角質(zhì)酶分子中的Serine 42側(cè)鏈在穩(wěn)定四面體中間產(chǎn)物中的作用，Anne Nicolas等[5]通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，將Serine 42突變?yōu)锳la，Asn84分別突變?yōu)锳la，Leu，Asp和Trp（因?yàn)锳sn直接影響著Ser42Oγ恰當(dāng)?shù)姆较颍?。結(jié)果顯示，野生型脂肪酶的活性與改造后的S42A突變體相比增加了450倍，但后者三維空間結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。N 84 A和N 84 L突變體的活性及三維空間結(jié)構(gòu)都沒(méi)有改變，但N 84 W 和N 84 D突變體幾乎喪失活性。表明Serine 42側(cè)鏈和其周圍的氨基酸殘基共同穩(wěn)定四面體中間產(chǎn)物;葡萄球菌CR53脂肪酶LipR有特殊的Y型氧陰離子洞序列，這在細(xì)菌脂肪酶中從未發(fā)現(xiàn)，為了探索這種不尋常的Y型氧陰離子洞結(jié)構(gòu)在葡萄球菌CR53脂肪酶LipR催化活性中的作用。Belen Infanzon和Pablo H. Sotelo及其同事通過(guò)QuikChange?定點(diǎn)突變的策略[7]，將LipR Y型氧陰離子洞結(jié)構(gòu)（YDS）轉(zhuǎn)變?yōu)楦咏?xì)菌中那些最常見的GGG（X）結(jié)構(gòu)。然而，在獲得的所有突變體中，活性完全喪失，表明LipR的Y型氧陰離子洞在酶催化活化中起著至關(guān)重要的作用。Amanda Fillat等 [12]為了提高EstBP7轉(zhuǎn)化TA酯的能力，就對(duì)-GGG（A）X-結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，最終篩選到了一株，在4 ℃下對(duì)叔醇乙酸酯有很高對(duì)映選擇性的突變株。這一研究對(duì)制藥工業(yè)中有價(jià)值的光學(xué)純叔醇的生物催化有很大的意義。定點(diǎn)突變具有明確的目標(biāo)位置，用以定向改變脂肪酶某些結(jié)構(gòu)的氨基酸組成進(jìn)而使其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，如提高其熱穩(wěn)定性、改變其對(duì)底物的對(duì)映選擇性等。經(jīng)修飾改變后得到的脂肪酶更符合工業(yè)應(yīng)用的需求，這是一種高效、簡(jiǎn)潔的突變方法。

2.2.2? 定點(diǎn)飽和突變

定點(diǎn)飽和突變主要包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變和盒式突變，其中最常用的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）介導(dǎo)的定點(diǎn)突變。定點(diǎn)飽和突變是在酶與底物結(jié)合區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)上進(jìn)行改造的主要策略，以改善有限的底物范圍、活性不足和穩(wěn)定性差等缺陷。該技術(shù)是在定點(diǎn)突變的基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的，雖然通過(guò)定點(diǎn)突變已經(jīng)在獲得具有改善催化性質(zhì)的酶方面取得了許多成功，但仍然存在許多不確定性因素，因此，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)飽和突變的方法得到了廣泛的應(yīng)用。在簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，根據(jù)密碼字的特點(diǎn)，最常用的系統(tǒng)為NNK，NDT，HCSM[16]，選擇合適的簡(jiǎn)并引物系統(tǒng)，能夠有效地縮小所需要篩選的文庫(kù)，增加篩選的效率。Belen Infanzon[7]為了探究Y型氧陰離子洞在脂肪酶LipR催化活化中的作用，通過(guò)QuikChange?進(jìn)行定點(diǎn)飽和誘變，用NNK簡(jiǎn)并密碼子（N為A，T，G或C，K為G或T）替換目標(biāo)密碼子，構(gòu)建脂肪酶LipR的Y110和D111位置可能編碼所有氨基酸的兩個(gè)基因文庫(kù)。結(jié)果表明，當(dāng)Tyr110被任何其他氨基酸取代時(shí)，獲得的LipR突變體都不具有活性。而突變體LipR D111G在短鏈或中鏈底物上顯示出比野生型LipR更低的活性，但在長(zhǎng)鏈底物上的活性比野生型增加5.6倍。

3? ? 結(jié)語(yǔ)

在實(shí)際的生產(chǎn)當(dāng)中，脂肪酶的用途十分廣泛，但其研發(fā)和應(yīng)用受到許多因素的制約，如脂肪酶的選擇性及催化機(jī)制、價(jià)格昂貴、回收困難、穩(wěn)定性較差等。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和微生物脂肪酶的高速發(fā)展，這些限制因素成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究脂肪酶的熱門方向。人們?cè)絹?lái)越多地使用生物技術(shù)手段對(duì)酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以改善不同來(lái)源脂肪酶的性質(zhì)，得到更多滿足人類需求的脂肪酶，達(dá)到利于人們生活、社會(huì)生產(chǎn)和人與自然和諧相處的目的。

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Research progress of lipase oxyanion hole

Wu Qinqin， Su Min

（Life Science College， Fujian Normal University， Fuzhou 350008， China）

Abstract： With the wide application of lipase in our production and life， people are increasingly using biotechnology to modify the molecular structure of enzyme proteins to improve the properties of lipases from different sources and to meet more human needs. The oxyanion hole is a catalytic element near the “pocket” of the lipase active center. Therefore， the oxyanion hole? structure plays an important role in the catalytic reaction of lipase， and it is also a research hotspot. In the past ten years， people have paid more attention to the study of lipase oxygen anion holes and made great progress.This paper studies and expounds this experiment.

Key words： lipase; oxyanion hole; catalytic element