閻優(yōu)優(yōu) 張博 張琪 周冬梅 林能明

中圖分類號(hào) R966；R735.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0499-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.14

摘 要 目的：觀察新型小分子激酶抑制劑Ibr-7[依魯替尼（Ibr）衍生物]對(duì)人胰腺癌Capan-2 細(xì)胞的抑制作用及其可能機(jī)制。方法：以Capan-2細(xì)胞為對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)1、2、4、8 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后的細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞存活率；同法檢測(cè)1 μmol/L Ibr、Ibr-7對(duì)不同劑量吉西他濱/紫杉醇（均分別為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）的增敏作用。采用克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)1、2、4 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后的細(xì)胞克隆形成情況，并記錄細(xì)胞集落形成數(shù)量。采用流式細(xì)胞術(shù)或JC-1法檢測(cè)2、4、8 μmol/L Ibr-7作用24或16 h后細(xì)胞凋亡情況和線粒體膜電位變化情況，并計(jì)算總凋亡率及細(xì)胞線粒體膜電位下降比例。采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白[多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）、Noxa、Bcl-2、Bax、髓樣細(xì)胞白血病1（Mcl-1）、B淋巴細(xì)胞瘤xL（Bcl-xL）]的表達(dá)情況。結(jié)果：1、2、4、8 μmol/L Ibr、Ibr-7作用48 h后，細(xì)胞的存活率均顯著下降，各劑量Ibr-7組均顯著低于同劑量Ibr組，且Ibr-7的半數(shù)抑制濃度顯著低于Ibr（P<0.05或P<0.01）。聯(lián)用Ibr、Ibr-7后，細(xì)胞的存活率均顯著低于同劑量吉西他濱/紫杉醇單用組，且Ibr-7聯(lián)用組顯著低于同劑量Ibr聯(lián)用組（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)2、4 μmol/L Ibr以及1、2、4 μmol/L Ibr-7作用48 h后，細(xì)胞集落形成數(shù)量均顯著減少，且各劑量Ibr-7組均顯著低于同劑量Ibr組（P<0.01）。經(jīng)不同劑量Ibr-7作用24或16 h后，Capan-2細(xì)胞的總凋亡率（2、4、8 μmol/L組）、細(xì)胞線粒體膜電位下降比例（8 μmol/L組）以及Noxa（2、4、8 μmol/L組）、Bax（8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著上升，PARP（8 μmol/L組）、Bcl-2（4 μmol/L組）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，且8 μmol/L Ibr-7組上述指標(biāo)（PARP、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量除外）均顯著優(yōu)于同劑量Ibr組（P<0.05或P<0.01）。而各組細(xì)胞Bcl-xL蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：與Ibr相比，Ibr-7對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖抑制作用和促凋亡作用，且具有更強(qiáng)的化療藥物增敏活性；其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)細(xì)胞中PARP、Bcl-2、Mcl-1蛋白的表達(dá)，上調(diào)Noxa、Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 依魯替尼；依魯替尼衍生物；人胰腺癌Capan-2 細(xì)胞；增殖；凋亡；線粒體膜電位；凋亡相關(guān)蛋白

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the inhibitory effects and possible mechanism of new small molecular kinase inhibitors Ibr-7 [Irutinil（Ibr） derivatives] on human pancreatic cancer Capan-2 cells. METHODS： Taking Capan-2 cells as objects， CCK-8 method was used to determine the proliferation of cells after treated with 1， 2， 4， 8 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h. The survival rates of cells were calculated. Sensitization effects of 1 μmol/L Ibr/Ibr-7 on different doses of gemcitabine/paclitaxel （0.062 5， 0.125， 0.25， 0.5， 1 μmol/L） were detected. Clone formation test was used to detect the situation of cell clone formation after treated with 1， 2， 4 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h. The number of cell colony formation was recorded. Flow cytometry or JC-1 method was used to detect the apoptosis of cells after treated with 2， 4， 8 μmol/L Ibr-7 for 24 or 16 h and the changes of mitochondrial transmembrane potential； total apoptotic rate and the percentage of mitochondrial membrane potential decrease were calculated. Western blotting was used to detect the expression of related apoptotic protein （PARP， Noxa， Bcl-2， Bax， Mcl-1， Bcl-xL）. RESULTS： After treated with 1， 2， 4， 8 μmol/L Ibr/Ibr-7 for 48 h， the survival rates of cells were decreased significantly； those of Ibr-7 groups were significantly lower than those of same-dose Ibr groups； IC50 of Ibr-7 was significantly lower than that of Ibr （P<0.05 or P<0.01）. After combined with Ibr/Ibr-7， the survival rate of cells was significantly lower than that of same-dose gemcitabine/paclitaxel alone group， and the Ibr-7 combination group was significantly lower than same-dose Ibr combination group （P<0.05 or P<0.01）. After treated with 2， 4 μmol/L Ibr and 1， 2， 4 μmol/L Ibr-7 for 48 h， the number of cell clone formation was decreased significantly， while Ibr-7 groups were significantly lower than same-dose Ibr groups （P<0.01）. After treated with different doses of Ibr-7 for 24 or 16 h， total apoptosis rate of cells （2， 4， 8 μmol/L）， the proportion of cell mitochondrial membrane potential decrease （8 μmol/L）， the relative protein expression of Noxa （2， 4， 8 μmol/L） and Bax （8 μmol/L） were increased significantly， while the protein expression of PARP （8 μmol/L）， Bcl-2 （4 μmol/L）， Mcl-1 （2， 4， 8 μmol/L） were decreased significantly； above indexes （except for relative expression of PARP and Bcl-2） of 8 μmol/L Ibr-7 group were significantly better than same-dose Ibr group （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in protein expression of Bcl-xL among those groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： Compared with Ibr， Ibr-7 has better inhibitory and apoptotic effects on human pancreatic cancer Capan-2 cells in vitro， and has stronger chemotherapeutic drug sensitization activity， the mechanism of which may be associated with reducing mitochondrial transmembrane potential， down-regulating the protein expression of PARP， Bcl-2 and Mcl-1 and up-regulating the protein expression of Noxa and Bax.

KEYWORDS Ibrutinib； Irutinil derivatives； Human pancreatic cancer Capan-2 cells； Proliferation； Apoptosis； Mitochondrial transmembrane potential； Apoptosis-related protein

胰腺癌是目前臨床患者5年生存率最低（僅為5%）的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期；加之晚期胰腺癌極易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及藥物耐受，使得其臨床治療處于瓶頸期[1-2]。吉西他濱作為胰腺癌化療的一線藥物，其臨床有效率僅為10%～15%[3-4]。盡管紫杉醇、伊立替康等藥物的出現(xiàn)在一定程度上優(yōu)化了胰腺癌的化療方案，但其靶向藥物的相關(guān)研究一直沒有突破性進(jìn)展[5]。因此，尋找有效的針對(duì)胰腺癌治療的小分子靶向藥物或合理的聯(lián)合給藥方案迫在眉睫。

依魯替尼（Ibr，結(jié)構(gòu)式見圖1A）是作用于B細(xì)胞抗原識(shí)別受體（BCR）信號(hào)通路的新型小分子靶向藥物，可靶向于Bruton酪氨酸激酶（Btk），目前已被美國FDA批準(zhǔn)用于慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）、套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）、華氏巨球蛋白血癥（WM）、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤（SLL）和邊緣區(qū)淋巴瘤（MZL）等B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床治療。近年多項(xiàng)臨床前和臨床研究均顯示，Ibr對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤均有較好的療效，但對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體外抑制活性較差[6-8]。本課題組前期篩選發(fā)現(xiàn)，與Ibr比較，其衍生物Ibr-7（結(jié)構(gòu)式見圖1B）對(duì)胰腺癌細(xì)胞株具有更明顯的體外抑制作用。在此基礎(chǔ)上，本研究考察了Ibr-7對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其可能機(jī)制，以期為胰腺癌治療藥物的開發(fā)和聯(lián)合用藥方案的設(shè)計(jì)提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SpectraMax M3型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Micro 21R型高速冷凍離心機(jī)、3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；SZ61型體式顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

Ibr原料藥（美國Selleck公司，批號(hào)：PCI-32765，純度：99.92%）；Ibr-7原料藥（杭州和正醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20161216，純度：>95%）；注射用鹽酸吉西他濱（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：160901，規(guī)格：0.2 g）；紫杉醇注射液（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：E150101，規(guī)格：16.7 mL ∶ 100 mg）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（美國Gibco公司，批號(hào)分別為1930017、1891605、1929955）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（美國MedChemExpress公司，批號(hào)：30116）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：SI255483）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素（Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司，批號(hào)：6119908）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：022618180620）；RIPA裂解液、5×Loading上樣緩沖液（北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為292343、291925AX）；10%蛋白電泳通用型預(yù)制膠（12孔）（杭州奧謙生物科技有限公司，批號(hào)：C30621712）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 μm，美國Millpore公司，批號(hào)：R7E8785B）；免疫印跡化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒以及辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（美國Abbkine公司，批號(hào)分別為ATRFE2801、ATRFE0501、ATRFE2801）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，批號(hào)：20180608XF；臨用前加水1 L混勻，即得TBST溶液）；兔抗人多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：9）；兔抗人PMAIP1（又稱Noxa）、Bax、Bcl-2、髓樣細(xì)胞白血病1（Mcl-1）、Bcl-xL單克隆抗體（美國Abcam公司，批號(hào)分別為GR1030343-9、GR3180247-17、GR251056-12、GR168628-1、GR26786-9）；鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（內(nèi)參，美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)：J0914）；其余試劑均為分析純，水為三蒸水。

1.3 細(xì)胞

人胰腺癌Capan-2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，以含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)Ibr、Ibr-7對(duì)細(xì)胞增殖活性和藥物敏感性的影響

2.1.1 細(xì)胞的增殖活性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中（每孔100 μL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組[Ibr、Ibr-7劑量均分別為1、2、4、8 μmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期試驗(yàn)的半數(shù)抑制濃度（IC50）]。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8檢測(cè)試劑的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1 h。采用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=給藥組細(xì)胞的平均OD值/空白對(duì)照組細(xì)胞的平均OD值×100%]；采用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算IC50。上述試驗(yàn)重復(fù)操作3次（下同）。

2.1.2 細(xì)胞的藥物敏感性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中（每孔100 μL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和吉西他濱單用組（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、紫杉醇單用組（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、Ibr單用組（1 μmol/L）、Ibr-7單用組（1 μmol/L）以及Ibr+吉西他濱聯(lián)用組、Ibr-7+吉西他濱聯(lián)用組、Ibr+紫杉醇聯(lián)用組和Ibr-7+紫杉醇聯(lián)用組（聯(lián)用組劑量均為1 μmol/L+0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L），各給藥組劑量設(shè)置均參考本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8檢測(cè)試劑的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1 h后，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組（Ibr、Ibr-7劑量分別均為1、2、4 μmol/L，劑量設(shè)置依據(jù)參考“2.1.1”項(xiàng)）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次，棄去上清液，加入含10%FBS的RPIM 1640培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1～2周。待克隆形成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，用0.1%結(jié)晶紫染色液染色1 h，用PBS洗凈后，晾干，用體式顯微鏡觀察細(xì)胞集落形成數(shù)量并拍照。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組（Ibr-7劑量分別為2、4、8 μmol/L，Ibr、吉西他濱的劑量均為8 μmol/L，劑量設(shè)置依據(jù)參考“2.1.1”項(xiàng)）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，收集貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用PBS清洗2次后，依次加入AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液100 μL以及AnnexinⅤ-FITC染液、PI染液各5 μL，混勻，染色15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，使用FACSDiva v8.0.1軟件計(jì)算細(xì)胞總凋亡率[細(xì)胞總凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率]。

2.4 JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化情況

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)16 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS清洗2次后，加入RPIM 1640培養(yǎng)基500 μL和JC-1工作液500 μL，混勻，染色30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜電位變化情況，使用FACSDiva v8.0.1軟件計(jì)算細(xì)胞線粒體膜電位下降比例。

2.5 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-2細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。各孔細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解后，采用BCA法以蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定其總蛋白濃度。蛋白經(jīng)上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃沸水中變性5 min，冷卻，1 000 r/min離心5 min，將沉淀置于-80 ℃保存，備用。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入PARP、Noxa、Bax、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL、β-actin一抗（1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。以ECL顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像并采用ImageJ 1.46r軟件進(jìn)行分析。以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Ibr、Ibr-7對(duì)Capan-2細(xì)胞增殖活性和藥物敏感性的影響

3.1.1 細(xì)胞的增殖活性 與空白對(duì)照組比較，經(jīng)不同劑量Ibr、Ibr-7作用48 h后，Capan-2細(xì)胞的存活率均顯著下降，且各劑量Ibr-7組的細(xì)胞存活率均顯著低于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；Ibr-7的IC50值為（2.3±0.2）μmol/L，顯著低于Ibr的（20.4±1.1）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見表1。

3.1.2 細(xì)胞的藥物敏感性 與空白對(duì)照組比較，經(jīng)不同劑量吉西他濱（0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）、紫杉醇（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）分別作用48 h后，Capan-2細(xì)胞的存活率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；聯(lián)用Ibr或Ibr-7后，Capan-2細(xì)胞的存活率均顯著低于同劑量吉西他濱、紫杉醇單用組，且聯(lián)用Ibr-7組的細(xì)胞存活率均顯著低于同劑量聯(lián)用Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2、表3。

3.2 Ibr、Ibr-7對(duì)Capan-2細(xì)胞克隆形成的影響

與空白對(duì)照組比較，各劑量Ibr、Ibr-7組的細(xì)胞集落形成明顯減少，2、4 μmol/L Ibr組以及1、2、4 μmol/L Ibr-7組的細(xì)胞集落形成數(shù)量均顯著減少，且各劑量Ibr-7組均顯著低于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見圖2、表4。

3.3 Ibr、Ibr-7對(duì)Capan-2細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較，各劑量Ibr-7組細(xì)胞的總凋亡率均顯著升高，且8 μmol/L Ibr-7組顯著高于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表5。

3.4 Ibr、Ibr-7對(duì)Capan-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與空白對(duì)照組比較，各劑量Ibr-7組細(xì)胞的線粒體膜電位均不同程度地降低，8 μmol/L Ibr-7組細(xì)胞的線粒體膜電位下降比例顯著升高，且顯著高于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見圖4、表5。

3.5 Ibr、Ibr-7對(duì)Capan-2細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，各劑量Ibr-7組細(xì)胞PARP（8 μmol/L組）、Bcl-2（4 μmol/L組）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，Noxa（2、4、8 μmol/L組）、Bax（8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高；且8 μmol/L Ibr-7組Noxa、Bax、Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；而Bcl-xL蛋白的相對(duì)表達(dá)量均未見顯著變化（P>0.05），詳見圖5、表6。

4 討論

Ibr是一種靶向B細(xì)胞淋巴瘤中BtK的小分子抑制劑，但對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體外抑制效果不佳。本課題組在前期研究中合成并篩選了一系列Ibr衍生物，發(fā)現(xiàn)Ibr-7對(duì)胰腺癌Capan-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。故在此基礎(chǔ)上，本研究采用CCK-8法檢測(cè)了Ibr、Ibr-7對(duì)細(xì)胞增殖活性和藥物敏感性的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量Ibr、Ibr-7（1～8 μmol/L）作用48 h后，Capan-2細(xì)胞的存活率均較空白對(duì)照組顯著降低，且Ibr-7的IC50值顯著低于Ibr。這提示這兩種化合物對(duì)Capan-2細(xì)胞的體外增殖均有一定的抑制作用，且Ibr-7的作用明顯強(qiáng)于Ibr。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，聯(lián)用1 μmol/L的Ibr或Ibr-7后，吉西他濱和紫杉醇對(duì)Capan-2細(xì)胞增殖的抑制作用均顯著增強(qiáng)（聯(lián)用組細(xì)胞的存活率均顯著低于同劑量吉西他濱、紫杉醇單用組）；且與聯(lián)用Ibr相比，聯(lián)用Ibr-7后抑制作用增強(qiáng)更為明顯。這提示Ibr-7可更明顯地提高Capan-2細(xì)胞對(duì)吉西他濱、紫杉醇的敏感性，但具體的增敏機(jī)制仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量（根據(jù)增殖試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，將劑量確定為1～4 μmol/L）Ibr、Ibr-7作用48 h后，Capan-2細(xì)胞的克隆形成受到明顯抑制，其細(xì)胞集落形成數(shù)量均較空白對(duì)照組顯著降低，且Ibr-7組顯著低于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示這兩種化合物對(duì)Capan-2細(xì)胞的克隆形成具有一定的抑制作用，且Ibr-7的抑制作用強(qiáng)于Ibr。

線粒體膜電位下降是細(xì)胞早期凋亡的重要標(biāo)志之一[9]。JC-1是一種陽離子染料，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，其可聚集至細(xì)胞基質(zhì)中，形成復(fù)合物而發(fā)出紅色熒光；而當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，JC-1則無法聚集，以單體形式存在而發(fā)出綠色熒光，故可根據(jù)熒光的變化來檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的改變情況[9]。本研究對(duì)細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量Ibr-7作用后，Capan-2細(xì)胞的總凋亡率（2、4、8 μmol/L組）和線粒體膜電位下降比例（8 μmol/L組）均較空白對(duì)照組顯著上升，且8 μmol/L Ibr-7組顯著高于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示與Ibr相比，Ibr-7可更明顯地促進(jìn)Capan-2細(xì)胞的凋亡、降低其線粒體膜電位。

腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白可通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用來調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，具有細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用[10]。該家族蛋白可根據(jù)功能差異分為抗凋亡蛋白（Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（Noxa、Bax等）。其中，Bcl-2主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，其在增強(qiáng)線粒體膜電位、保持線粒體內(nèi)外膜的完整性等方面起著重要作用；而Bax蛋白則可直接激活死亡效應(yīng)因子胱天蛋白酶（Caspase），從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；此外，Bcl-2還可與Bax結(jié)合形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；故當(dāng)Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)，兩者的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，異源二聚體的合成明顯減少，細(xì)胞凋亡得以發(fā)生[11]。由此可見，以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白是腫瘤治療的有效靶點(diǎn)之一。Mcl-1是Bcl-2家族蛋白中主要的抗凋亡蛋白，可通過與Noxa等促凋亡蛋白的結(jié)合來調(diào)控其自身的表達(dá)水平和降解能力[12-13]。Bcl-xL可通過降低細(xì)胞線粒體膜的通透性、抑制細(xì)胞色素等一系列物質(zhì)的釋放來發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[14]。PARP作為細(xì)胞凋亡核心成員Caspase的切割底物，其在DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[15]。由此可見，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能成為有效的抗癌策略之一。本研究結(jié)果顯示，不同劑量Ibr-7組細(xì)胞中PARP（8 μmol/L組）、Bcl-2（4 μmol/L組）、Mcl-1（2、4、8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，Noxa（2、4、8 μmol/L組）、Bax（8 μmol/L組）蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示Ibr-7可通過調(diào)控線粒體凋亡蛋白PARP、Noxa、Bax、Bcl-2、Mcl-1等的表達(dá)來發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。此外本研究結(jié)果還顯示，8 μmol/L Ibr-7組細(xì)胞Noxa、Bax、Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于同劑量Ibr組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示與Ibr比較，Ibr-7對(duì)促凋亡蛋白Noxa、Bax具有更強(qiáng)的上調(diào)作用，而對(duì)Mcl-1的下調(diào)作用則相對(duì)較弱。但本研究并未發(fā)現(xiàn)Ibr-7對(duì)Bcl-xL表達(dá)的影響。

綜上所述，與Ibr相比，Ibr-7對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖抑制作用和促凋亡作用，且具有更強(qiáng)的化療藥物增敏活性；其作用機(jī)制可能與降低線粒體膜電位，下調(diào)細(xì)胞中PARP、Bcl-2、Mcl-1蛋白的表達(dá)，上調(diào)Noxa、Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。由此可見，Ibr-7有望成為一種有效的新型抗胰腺癌小分子靶向藥物，具有一定的開發(fā)價(jià)值。但本研究?jī)H初步探討和比較了Ibr、Ibr-7的體外增殖抑制作用、增敏作用和促凋亡作用，而其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2018-05-10 修回日期：2018-12-06）

（編輯：張?jiān)拢?/p>