梁桂洪 梁祖建 謝平金 潘建科 曾令烽 楊偉毅 黃和濤 韓燕鴻 劉軍

中圖分類號 R274.9；R96 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0448-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.04

摘 要 目的：研究川芎嗪對膝骨性關節(jié)炎（KOA）模型大鼠軟骨下骨中微小核糖核酸miR-20b/血管內皮生長因子（VEGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）/Smad1通路的影響，并探討川芎嗪防治KOA的作用機制。方法：取健康雄性SD大鼠18只，隨機分為正常對照組、模型組、川芎嗪組，每組6只。對后兩組大鼠通過膝關節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶溶液建立KOA模型。末次注射后第2天起，川芎嗪組大鼠灌胃川芎嗪混懸液（100 mg/kg）2 mL，正常對照組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。給藥結束后，暴露大鼠雙側膝關節(jié)軟骨進行大體情況觀察。截取大鼠膝關節(jié)，進行切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察組織病理學變化，并采用改良的Mankin’s評分進行組織學評分。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA表達和miR-20b表達水平；采用Western Blot法檢測VEGF、BMP2、Smad1的蛋白表達水平。結果：模型組和川芎嗪組大鼠的膝關節(jié)均出現不同程度的軟骨損傷；與正常對照組比較，模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織Mankin’s評分顯著升高（P<0.01）；軟骨下骨組織中BMP、Smad1的mRNA和蛋白表達以及miR-20b表達水平均顯著降低，VEGF的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠關節(jié)軟骨組織Mankin’s評分顯著降低（P<0.01）；軟骨下骨組織中BMP、Smad1的mRNA和蛋白表達以及miR-20b表達水平均顯著升高，VEGF的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：川芎嗪能修復KOA模型大鼠損傷的關節(jié)軟骨，其機制可能是通過上調軟骨下骨中miR-20b表達水平，促進VEGF mRNA降解繼而抑制VEGF蛋白的表達，同時激活BMP-2/Smad1信號通路而實現的。

關鍵詞 川芎嗪；膝骨性關節(jié)炎；軟骨下骨；大鼠；miR-20b；血管內皮生長因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；Smad；作用機制

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of ligustrazine on miR-20b/VEGF and BMP2/Smad1 pathways in subchondral bone of knee osteoarthritis （KOA） model rats， and to investigate the mechanism of ligustrazine for KOA prevention and treatment. METHODS： Totally 18 healthy male SD rats were randomly divided into normal control group， model group and ligustrazine group， with 6 rats in each group. The rats in the latter two groups were used to establish KOA model by intra-articular injection of 4% papain solution. From the 2nd day after the last injection， ligustrazine group was given intragastrical administration of Ligustrazine suspension （100 mg/kg） 2 mL； normal control group and model group were given intragastrical administration of isometrical normal saline， once a day， for consecutive 6 weeks. After the last after medication， the situation of bilateral knee articular cartilage of rats were observed after exposure. The knee joints of rats were sectioned and stained with HE. The pathological change of articular cartilage were observed by microscope and scored by modified Mankin’s score. mRNA expression of VEGF， BMP2 and Smad1， and the expression of miR-20b were detected by RT-PCR； the protein expression of VEGF， BMP2 and Smad1 were detected by Western blot assay. RESULTS： Model group and ligustrazine group suffered from cartilage injury of knee joint at varying degrees. Compared with normal control group， Mankin’s scores of knee joint and cartilage tissue were increased significantly in model group （P<0.01）； mRNA and protein expression of BMP and Smad1， the expression of miR-20b in subchondral bone of model group were decreased significantly， while mRNA and protein expression of VEGF were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， Mankin’s score of cartilage tissue were decreased significantly in ligustrazine group （P<0.01）； mRNA and protein expression of BMP and Smad1， the expression of miR-20b in subchondral bone were increased significantly， while mRNA and protein expression of VEGF were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Ligustrazine can repair damaged articular cartilage in KOA model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting the protein expression of VEGF and activating BMP-2/Smad1 signaling pathway via up-regulating the expression of miR-20b， and promoting the degradation of VEGF mRNA in subchondral bone.

KEYWORDS Ligustrazine； Knee osteoarthritis； Subchondral bone； Rat； miR-20b； VEGF； BMP； Smad； Mechanism

膝骨性關節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）的發(fā)生與發(fā)展涉及韌帶、肌肉、滑膜、關節(jié)軟骨和軟骨下骨等關節(jié)周圍組織的結構病變，目前大多數相關研究主要以軟骨自身修復為主，而忽略了周圍組織或軟骨下骨對軟骨修復的影響[1]。近來有研究者認為，在骨關節(jié)炎（OA）發(fā)生過程中，軟骨下骨的病變可能早于關節(jié)軟骨的退變，并提出關節(jié)軟骨的完整性可能取決于軟骨下骨的力學性能[2]；另有研究發(fā)現，調控軟骨下骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路可能有助于促進關節(jié)軟骨的再生修復[3]。由于軟骨下骨和關節(jié)軟骨有共同的組織細胞起源，BMP-Smad信號通路可能共同調節(jié)軟骨下骨的骨重塑和關節(jié)軟骨的生長發(fā)育[4]，因此調控兩者共有的信號通路可能在軟骨下骨和軟骨生長發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現，微小核糖核酸（miRNA）可通過調節(jié)血管內皮生長因子（VEGF）的表達來干預關節(jié)組織的炎性反應及血管再生，從而參與OA的進展[5]；而在OA患者的軟骨下骨中發(fā)現有大量血管增生，其機制可能是新生血管侵入鈣化軟骨層及非鈣化軟骨，激活軟骨下骨的重塑過程，進而引發(fā)關節(jié)軟骨的退變[6]。川芎嗪是從川芎中提取的一種有效活性物質，其能通過上調抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax、Caspas-3的表達，從而抑制軟骨細胞的凋亡[7]；或者通過降低OA大鼠關節(jié)液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）的含量，對減輕OA炎性反應有一定的作用[8]；或者通過降低OA患者關節(jié)液中基質細胞衍生因子1（SDF-1）、基質金屬蛋白酶（MMPs）水平從而提高治療效果[9]，但相關作用機制尚不明確。為此，本課題組對川芎嗪能否通過調控膝骨軟骨與軟骨下骨共有的miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號通路從而影響軟骨下骨的骨重建過程進行研究，為臨床使用川芎嗪治療KOA提供實驗依據和治療思路。

1 材料

1.1 儀器

XP205型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；RM2125RTS型輪轉式石蠟切片機（德國Leica公司）；D3024型臺式高速離心機（美國SCIlogex公司）；7500型實時熒光定量-聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；SMA4000型微量核酸定量儀（美國Merinton公司）；318型多功能酶標儀（上海現科儀器有限公司）；Aquaplore 3型超純水機（美國Aquapro公司）。

1.2 藥品與試劑

磷酸川芎嗪片（麗珠集團利民制藥廠，批號：160703，規(guī)格：50 mg）；木瓜蛋白酶（上海源葉科技有限公司，批號：S10011，活性：800 U/mg）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，批號：DH0006）；Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司，批號：DP424）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、苯甲基磺酰氟（PMSF）（杭州弗德生物科技有限公司，批號分別為FD2001、FD008、FD1001、FD1002、FD100）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0012A）；反轉錄試劑盒（上海星漢生物科技有限公司，批號：DBI-2220）；PCR引物（廣州四和生物科技有限公司）；熒光定量PCR檢測試劑盒（美國Genecopoeia公司，批號：AOPR-1200）；VEGF兔多克隆抗體、BMP2兔多克隆抗體、Smad1兔多克隆抗體（英國Abcam公司，批號分別為Ab46154、Ab14933、Ab131371）；β-actin抗體（內參）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為3700、BA1054、AR1112）；ECL發(fā)光液（德國Merck公司）；其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康雄性SD大鼠18只，3月齡，體質量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SYXK（粵）2016-0023。所有大鼠均在環(huán)境溫度（25±1）℃、濕度68%、12 h光照/黑暗交替的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，任意進食標準飼料和自來水。本實驗方案通過廣州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、川芎嗪組，每組6只。對模型組、川芎嗪組大鼠采用關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立KOA模型：在無菌條件下以生理鹽水配制4%木瓜蛋白酶溶液，于4 ℃保存，在實驗開始前4 h取出放至室溫備用；對大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，在其雙膝關節(jié)處備皮、消毒并屈曲約45°，從髕骨下緣前內側的膝眼向髁間窩方向進針，待明顯有落空感后，針尖抵達股骨內側髁再回撤2 mm，然后注射4%木瓜蛋白酶溶液（雙側膝關節(jié)腔均注射0.2 mL），在第1、4、7天分別注射1次，共注射3次[10]。正常對照組大鼠同法注射等體積生理鹽水。自造模第1天起，每天驅趕大鼠活動2次，每次1 h，連續(xù)驅趕1周。

末次注射木瓜蛋白酶或生理鹽水第2天起，川芎嗪組大鼠灌胃川芎嗪混懸液（100 mg/kg，參考文獻[11]確定劑量；取川芎嗪片以生理鹽水配制成適當濃度后給藥）2 mL，正常對照組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。

2.2 大鼠軟骨組織大體情況和組織病理學觀察

給藥結束后，斷頸處死全部大鼠，解剖雙側膝關節(jié)并暴露關節(jié)軟骨，大體觀察關節(jié)軟骨光滑度、色澤，表面是否有糜爛、潰瘍及纖維性增生，邊緣是否有骨贅形成等情況。剔除膝關節(jié)周圍的肌肉組織，在脛骨近端1/4至股骨遠端1/4的范圍截取整個膝關節(jié)。一部分膝關節(jié)組織于-80 ℃條件下保存?zhèn)錅y；另一部分膝關節(jié)組織在4 ℃條件下置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，然后脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟標本，行厚切片（4～6 μm）。切片以HE染色后在顯微鏡下觀察；采用改良的Mankin’s評分[12]對軟骨組織結構、細胞、染色以及潮線的完整性進行組織學評分，評分范圍為0～13分，評分越高表明軟骨退變越嚴重。

2.3 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1 的mRNA和miR-20b表達水平檢測

采用逆轉錄（RT）-PCR法進行檢測。取“2.2”項下部分凍存膝關節(jié)組織，采用Trizol試劑分別提取軟骨下骨總RNA和mRNA，采用反轉錄試劑盒制得cDNA第一鏈，然后行RT-PCR擴增，引物序列見表1，擴增條件見表2。采用2-ΔΔCt法[13]，以GAPDH為內參計算VEGF、BMP2、Smad1的mRNA表達水平，以U6為內參計算miR-20b的表達水平。

2.4 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的蛋白表達水平檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.2”項下部分凍存膝關節(jié)組織，采用全蛋白提取液（RIPA裂解液-蛋白酶抑制劑混合物-蛋白磷酸酶抑制劑混合物-PMSF的體積比為100 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）提取軟骨下骨全蛋白，采用Bradford比色法測定蛋白濃度。離心收集軟骨下骨全蛋白，加入SDS蛋白上樣緩沖液×5次，95 ℃孵育5 min，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩７謩e采用濃縮膠和分離膠進行蛋白電泳，235 mA轉膜60～120 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。將PVDF膜分別放入VEGF、BMP2、Smad1、β-actin抗體稀釋液（1 ∶ 1 000）3 mL中，4 ℃孵育過夜，次日以TBST緩沖液洗膜5 min×4次；再將PVDF膜放入二抗稀釋液（1 ∶ 20 000）3 mL中，室溫下平緩搖動孵育1 h后，以TBST緩沖液洗膜5 min×4次；采用ECL發(fā)光液顯色。采用Image J 1.46r 軟件對蛋白條帶進行分析，以β-actin為內參計算相對灰度值，以表示蛋白表達水平。

2.5 統計學方法

所有試驗至少獨立重復3次。采用GraphPad Prism 7統計軟件進行數據處理。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s或Dunnett’s檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠關節(jié)軟骨大體情況及組織病理學觀察結果

肉眼觀察可見，與正常對照組比較，模型組和川芎嗪組大鼠的關節(jié)均出現不同程度的軟骨損傷，包括關節(jié)軟骨光滑度下降、色澤變暗淡，表面不平整并伴有糜爛，無骨贅形成。但兩組間大體情況無明顯差別。組織切片HE染色后在鏡下可見，正常對照組大鼠關節(jié)軟骨結構清晰，軟骨表面完整、光滑，基質染色基本均勻；模型組大鼠關節(jié)軟骨淺表層纖維化，表面完整性被破壞，軟骨細胞成簇增殖、肥大、排列紊亂，潮線不完整或消失，基質染色丟失；川芎嗪組大鼠關節(jié)軟骨表層不平整，偶見少量簇集的軟骨細胞，基質染色尚可。改良的Mankin’s評分結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠軟骨組織評分顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨組織評分顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。各組大鼠關節(jié)軟骨組織病理學顯微圖見圖1，Mankin’s評分柱形圖見圖2。

3.2 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達水平

與正常對照組比較，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA表達水平顯著升高，BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨下骨組織中VEGF 的mRNA表達水平顯著降低，BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b的表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的mRNA和miR-20b表達水平柱形圖見圖3。

3.3 大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP-2、Smad1的蛋白表達水平

與正常對照組比較，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的蛋白表達水平顯著升高，BMP2、Smad1的蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，川芎嗪組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的蛋白表達水平顯著降低，BMP2、Smad1的蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。各組大鼠軟骨下骨組織中VEGF、BMP2、Smad1的蛋白電泳圖見圖4，蛋白表達水平柱形圖見圖5。

4 討論

OA是一種以關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨反應性增生及硬化，并伴隨骨贅形成為主要病理特點的疾病，其在臨床上最直觀的病理改變是軟骨受損、退變，因此對OA的防治工作主要集中在關節(jié)軟骨方面[14]。本課題組前期研究發(fā)現，與OA模型組比較，正常對照組、陽性藥物組（塞來昔布）和川芎嗪高、低劑量組（100、50 mg/kg）大鼠關節(jié)軟骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高；與陽性藥物組比較，川芎嗪高劑量組大鼠關節(jié)軟骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而川芎嗪低劑量組上述指標水平則降低[15]。另通過研究證實，川芎嗪可上調KOA模型大鼠關節(jié)軟骨中miR-20b的表達水平，下調VEGF的mRNA和蛋白表達水平，且高劑量川芎嗪的效果優(yōu)于低劑量川芎嗪和陽性藥物塞來昔布[16-17]。因此本研究重點探索高劑量川芎嗪對大鼠膝關節(jié)軟骨下骨中上述相關基因表達的影響。

本研究結果顯示，大鼠關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶后，關節(jié)軟骨組織的Mankin’s評分較正常對照組顯著升高；而以川芎嗪干預處理后可降低關節(jié)軟骨組織的Mankin’s評分，減輕大鼠軟骨退變程度。RT-PCR和Western blot法檢測結果顯示，模型組大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA和蛋白表達水平較正常對照組均顯著升高，而BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達以及miR-20b表達水平均顯著降低；而以川芎嗪干預處理后大鼠軟骨下骨組織中VEGF的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達以及miR-20b表達水平均顯著升高。這表明在KOA發(fā)展過程中，大鼠軟骨下骨中的miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號通路均發(fā)生了明顯改變，而川芎嗪可逆轉這種現象。

VEGF是一個重要的促進血管生成因子，可由破骨細胞、成骨細胞、骨細胞以及軟骨細胞產生，其過度表達可引起軟骨下骨血管異常新生，或者誘發(fā)軟骨細胞炎性反應[18]。有研究顯示，在胚胎肢體發(fā)育過程中，可通過抑制VEGF的表達來誘導肌肉來源干細胞向軟骨分化，進一步促進缺損軟骨的修復[19]。而部分miRNA則可通過調節(jié)VEGF的表達來激活關節(jié)局部炎性反應以及血管再生，從而參與到OA的進程中[20]。研究表明，miR-20b可通過靶向作用于缺氧誘導因子1（HIF-1）、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3），從而間接調控VEGF的表達[21]；可直接靶向作用于VEGF3′-非編碼區(qū)，從而抑制VEGF的表達[22]。這表明干預miR-20b/VEGF信號通路的表達將有助于調控軟骨下骨的血管生成及炎性反應。結合前期研究結果表明，川芎嗪可能是通過上調軟骨及軟骨下骨中miR-20b表達，促進VEGF mRNA降解，繼而抑制VEGF蛋白的表達，從而抑制血管侵入鈣化軟骨層，維持軟骨下骨及骨小梁的重塑平衡，并抑制新生血管蔓延至非鈣化軟骨，來發(fā)揮緩解炎性反應和關節(jié)軟骨退變的作用。

BMP2是BMPs蛋白家族中的一員，可調節(jié)骨生成與吸收的平衡，在骨重塑過程中發(fā)揮著重要作用；也可通過調節(jié)細胞外基質發(fā)揮軟骨保護及修復的作用[23]。已有研究證實，BMP2可加快軟骨損傷后的軟骨修復進程，減少纖維軟骨的形成從而改善軟骨基質的外觀和構成[24]；也有研究顯示，通過干預軟骨下骨BMPs相關蛋白的表達可促進關節(jié)軟骨的再生修復[3]。而Smad1/5和Smad4對破骨細胞的分化有重要作用，其形成的BMP-Smad信號通路參與了骨重塑的過程[25]。本實驗結果也證實，川芎嗪可上調OA大鼠軟骨下骨組織中BMP2、Smad1的mRNA和蛋白表達。結合前期研究結果表明，川芎嗪可能通過調控關節(jié)軟骨及軟骨下骨BMP2/Smad信號通路從而調控軟骨下骨的骨重塑過程。

綜上所述，川芎嗪能修復KOA模型大鼠損傷的關節(jié)軟骨，其機制可能是通過上調軟骨及軟骨下骨中miR-20b表達，促進VEGF mRNA降解繼而抑制VEGF蛋白的表達，同時激活BMP2/Smad1信號通路而實現的。但軟骨下骨與關節(jié)軟骨中miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號通路之間是否存在相互調節(jié)的作用，而它們之間又是如何調控的？miR-20b是否通過靶向作用于VEGF來調控BMP2/Smad1信號通路的活性，從而影響軟骨下骨骨重塑的穩(wěn)態(tài)并進一步調節(jié)軟骨修復？對以上問題，本課題后續(xù)擬進一步研究探索miR-20b/VEGF和BMP2/Smad1信號通路之間的調控關系，深入揭示川芎嗪臨床防治KOA的分子機制。

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（收稿日期：2018-08-29 修回日期：2019-01-02）

（編輯：段思怡）