李萌　馬致潔　章從恩　章前　于衛(wèi)東　陳熹　趙奎君

摘要?目的：優(yōu)化構(gòu)建抗抑郁研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討西紅花對(duì)皮質(zhì)酮（CORT）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：觀察不同濃度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞24 h、36 h、48 h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，優(yōu)化構(gòu)建抑郁體外模型;不同濃度（2.5、5、10 μg/mL）西紅花預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察西紅花對(duì)CORT（500 μmol/L）細(xì)胞損傷后的保護(hù)作用;檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性，判斷藥物對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用;使用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)藥物對(duì)CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用;檢測(cè)細(xì)胞裂解液中Caspase-3活性，判斷藥物作用與Caspase蛋白通路相關(guān)性。結(jié)果：CORT（0～1 000 μmol/L）作用PC12細(xì)胞，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加而逐漸降低，依劑量呈線性關(guān)系;當(dāng)西紅花濃度>100 μg/mL時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞存活的影響出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西紅花預(yù)處理后，細(xì)胞存活率由模型組（53.31±4.18）%，上升為（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%;西紅花預(yù)處理組LDH釋放量顯著低于模型組（P<0.05）;西紅花能夠明顯抑制CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，西紅花可抑制Caspase-3的表達(dá)。結(jié)論：西紅花對(duì)CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞有一定保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞?西紅花;皮質(zhì)酮;PC12細(xì)胞;誘導(dǎo);細(xì)胞損傷;模型;抑郁

Protective Effects of the Crocus sativus L on CORT Induced PC12 Cell Injury

Li Meng1，Ma Zhijie1，Zhang Congen1，Zhang Qian2，Yu Weidong3，Chen Xi1，Zhao Kuijun1

（1 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Beijing Keyuan Xinhai Pharmaceutical Business Co.，Ltd.，Beijing 100160，China; 3 Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.，Ltd.，Shanghai 200002，China）

Abstract?Objective：To optimized the establishment of a model of depression in vitro，and to explore the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT and its related mechanisms.Methods：PC 12 cells were treated with CORT in different concentrations （0，125，250，500，750 and 1 000 μmol/mL） for 24，36 and 48 h to establish a depression model in vitro.PC12 cells were pretreated with Crocus sativus L at different concentrations （2.5，5 and 10 ug/mL） for 24 hours.Cell viability was measured by CCK-8，and the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT were determined.The levels of LDH activity in supernatant were detected to judge the protection effect of the drugs on PC12 cells.The protective effect on PC12 apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining.Caspase-3 activity was detected in cell lysates and correlation between drug action and Caspase protein pathway was judged.Results：After CORT （0-1 000 μmol/L） treatment of PC12 cells for 24 h，the cell survival rates of each concentration were decreased with dose increasing in a dose-dependent manner.When the concentration of Crocus sativus Lextract was greater than 100 μg/mL，the effect on PC12 cells was statistically significant.After drug pretreatment，the PC12 cells survival rate was increased from model group （53.31±4.18）% to （57.46±2.76）%，（60.48±2.73）%，（61.99±3.05）%，（61.38±2.26）%，（59.46±2.41）% and （58.64±3.74）%，respectively.The release of LDH from Crocus sativus L pretreated group was significantly lower than that of model group （P<0.05）.Crocus sativus L can significantly inhibit CORT-induced apoptosis of PC12 cells.Crocus sativus Lcan inhibit the expression of Caspase-3.Conclusion：Crocus sativus L has the protective effects on PC12 cell injury induced by CORT.

Key Words?Crocus sativus L; Corticosterone （CORT）; PC12 cells; Induced; Cell injury; Model; Depression

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.009

抑郁癥，以持久而顯著的心境和情緒低落為主要臨床表現(xiàn)，是心境障礙的主要類型[1]。抑郁癥患者除情緒低落外，至少包含2種以上其他癥狀，包括失眠或嗜睡、易疲勞、飲食量改變以及出現(xiàn)自卑或絕望感等[2]。如不加以控制，會(huì)發(fā)展為更為嚴(yán)重的如雙向情感障礙等疾病，又因其不易被發(fā)現(xiàn)且病情綿長(zhǎng)的特點(diǎn)導(dǎo)致抑郁癥的治療成為臨床的難點(diǎn)[3]。目前臨床治療抑郁癥的首選藥物為是五羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs），例如西酞普蘭、舍曲林和氟西汀等，但藥物的有效性不足六成，且起效時(shí)間平均需要6-8周[4]。與此同時(shí)，SSRIs的不良反應(yīng)較多，例如患者骨折風(fēng)險(xiǎn)增加、出現(xiàn)靜坐不能和性功能障礙以及自殺傾向等較為嚴(yán)重的病癥[5]。因此有效且不良反應(yīng)小的抗抑郁癥藥物的研發(fā)有著重要意義。

《本草綱目》中記載，西紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬植物的干燥柱頭，可“主心憂郁積，氣悶不散，活血，久服令人心喜”[6]?，F(xiàn)代中醫(yī)在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，西紅花可以治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病等。因此西紅花治療異常心理狀態(tài)或行為的療效逐漸被人們關(guān)注[7]。目前，有部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西紅花具有抗抑郁的藥效，但在細(xì)胞水平的研究成果較少。本研究使用皮質(zhì)酮（CORT）作用于低分化PC12細(xì)胞，建立抑郁癥體外模型。通過觀察西紅花對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，探討藥物的細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用，為西紅花對(duì)抑郁癥的防治提供進(jìn)一步的研究依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞?PC12細(xì)胞（購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）用含10%的胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，2～3 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2?藥物?西紅花（上海藥材公司，批號(hào)：16120530）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為鳶尾科番紅花屬西紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭;皮質(zhì)酮（Corticosterone）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：BCBP9232V）。

1.1.3?試劑與儀器

胎牛血清（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：1624110）;RPMI Medium 1640 basic（1×）培養(yǎng)基（美國(guó)gibco公司，批號(hào)：8118083）;青鏈霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)：68045655）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：AD17628286）;0.25%胰蛋白酶溶液（美國(guó)gibco公司，批號(hào)：1928609）;CCK-8（日本Dojindo Lab公司，貨號(hào)53445）;二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：11381217）;乳酸脫氫酶試劑盒（LDH）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：446553）;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：748957）;Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C1116）。

生物安全柜（美國(guó)Nuaire公司，型號(hào)：Labgard NV-425-400s）;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Nuaire公司，型號(hào)：NV-5510E）;倒置生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：Leica DMi1）;離心機(jī)（北京白洋離心機(jī)廠，型號(hào)：400C）;酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司，型號(hào)：SpectraMax M3）;熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：DMI3000B）;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-rad公司，型號(hào)：TC20）;小型冷凍高速離心機(jī)離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：5424R）;超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)：Milli-Q）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司，型號(hào)：BSA224S-CW）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ3200E）;-80 ℃醫(yī)用低溫冰箱[日本SANYO公司，型號(hào)：MDF-382E（N）];恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：DK-99-ll）。

1.2?方法

1.2.1?分組與藥物制備

1.2.1.1?CORT損傷模型構(gòu)建分組?1）正常對(duì)照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）CORT模型組：100 μL含CORT濃度為：0、125、250、500、750、1 000 μmol/L的1%胎牛血清培養(yǎng)液，分別處理24、36、48 h。處理結(jié)束，檢測(cè)細(xì)胞存活率[8]。

1.2.1.2?西紅花毒性劑量篩選分組?1）正常對(duì)照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）西紅花組：西紅花儲(chǔ)備液用1%胎牛血清培養(yǎng)基配置不同濃度（此濃度為折算后的西紅花藥材濃度，簡(jiǎn)稱西紅花濃度）：10、50、100、150、200 μg/mL，培養(yǎng)24 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.1.3?西紅花給藥分組?1）正常對(duì)照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）CORT損傷模型組（M）：500 μmol/L CORT處理3）西紅花給藥組：含1%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋西紅花儲(chǔ)備液至不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL），均預(yù)給藥24 h，之后加入500 μmol/L CORT處理24 h，結(jié)束后檢測(cè)細(xì)胞存活率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇低、中、高劑量組（簡(jiǎn)寫為CL、CM、CH）。以下實(shí)驗(yàn)均按該分組方式處理，收集細(xì)胞或培養(yǎng)上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.4?藥物制備?稱量34.6 mg CORT溶于1 mL DMSO溶液中，制成濃度為100 mmol/L的儲(chǔ)備液備用。稱量1 g西紅花藥材，粉碎后加入10 mL 75%乙醇超聲提取2 h，過濾，4 ℃放置一晚，濃縮后冷凍干燥，得提取物0.5 g，計(jì)算提取率約50%。西紅花提取物溶于水中，配置成2 mg/mL西紅花原藥材儲(chǔ)備液，4 ℃存儲(chǔ)備用。

1.2.2?檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.2.1?CCK-8細(xì)胞存活率檢測(cè)?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，生長(zhǎng)24 h，之后按照不同實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，處理完成后，每孔加入10 μL的CCK-8，并設(shè)置空白對(duì)照，37 ℃孵育90 min后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白對(duì)照組）/（對(duì)照組-空白對(duì)照組）×100%[9]。

1.2.2.2?細(xì)胞形態(tài)觀察?PC12細(xì)胞經(jīng)造模給藥處理后，于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2.3?乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)?以5×105個(gè)/孔細(xì)胞向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種PC12細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗(yàn)方法分組處理后，收集上清液，1 000 r/min離心5 min，進(jìn)行乳酸脫氫酶測(cè)定，方法參照說明書。

1.2.2.4?Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)?以5×105個(gè)/孔細(xì)胞向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種PC12細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗(yàn)方法分組處理后，進(jìn)行Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)，方法參照試劑盒說明書，在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

LDH活性（U/L）=測(cè)定值-對(duì)照值標(biāo)準(zhǔn)值-空白值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×1 000

1.2.2.5?Caspase-3活性檢測(cè)?以5×105個(gè)/孔細(xì)胞向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種PC12細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗(yàn)方法分組處理后，進(jìn)行Caspase-3活性檢測(cè)，方法參照試劑盒說明書。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?CORT損傷模型的選擇?采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示，不同濃度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）CORT處理PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別是（100.00±1.37）%、（80.77±2.65）%、（76.94±1.60）%、（49.54±1.82）%、（36.71±2.14）%、（15.54±4.00）%，處理36 h后，細(xì)胞存活率分別是（100.00±1.76）%、（69.36±1.32）%、（55.92±1.25）%、（46.71±2.44）%、（14.84±0.94）%、（1.53±0.32）%處理48 h后細(xì)胞存活率分別是（100.00±7.73）%、（56.93±5.21）%、（56.15±6.11）%、（44.26±5.20）%、（18.24±2.05）%、（0.70±0.83）%，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加而逐漸降低，依劑量呈線性關(guān)系。500 μmol/L CORT處理PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率下降到（49.54±1.82）%（P<0.01），引起約半數(shù)的PC12細(xì)胞死亡，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇濃度500 μmol/L處理24 h為本實(shí)驗(yàn)的損傷模型。

2.2?西紅花毒性劑量?不同濃度西紅花處理細(xì)胞24 h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率為（100±6.18）%、（101.56±5.22）%、（96.37±4.58）%、（94.51±4.01）%、（94.05±2.96）%、（93.50±3.52）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)西紅花濃度大于100 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2），表明對(duì)細(xì)胞的存活有影響，因此選擇西紅花的濃度應(yīng)小于100 μg/mL。

2.3?西紅花的細(xì)胞保護(hù)作用?不同濃度西紅花預(yù)處理細(xì)胞24 h后，加入500 μmol/L CORT作用24 h，細(xì)胞存活率由模型組（53.31±4.18）%，上升為（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%。結(jié)果提示，西紅花對(duì)CORT引起的損傷具有保護(hù)作用，其中2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL時(shí)，細(xì)胞保護(hù)作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖3）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL作為西紅花處理的低（CL）、中（CM）、高（CH）劑量濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組[10]。

2.4?細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察?倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞，呈圓形、橢圓形或多角形，有的可見突觸，貼壁生長(zhǎng)，折光性強(qiáng)。經(jīng)CORT處理后，細(xì)胞突觸收縮，細(xì)胞膜粗糙，折光性下降，貼壁狀態(tài)差甚至漂浮死亡。西紅花提取物處理組可見細(xì)胞損傷減弱，活細(xì)胞增多。見圖4。

2.5?LDH活性?LDH廣泛存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞膜受損傷后，胞質(zhì)中的LDH釋放到培養(yǎng)基中，通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH活性可以反映細(xì)胞的損傷程度[11]。本實(shí)驗(yàn)正常組LDH活性為（245.39±22.35）U/L，模型組為（439.30±32.03）U/L，CL組為（421.63±20.41）U/L，CM組為（394.67±8.96）U/L，CH組為（348.95±28.57）U/L。測(cè)定結(jié)果顯示，CORT損傷組與對(duì)照組比，LDH活性顯著升高（**P<0.01）;藥物保護(hù)組與模型組比顯著降低（△P<0.05）。見圖5。

2.6?Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)?通過Annexin V-FITC/PI雙染色法，使用熒光顯微鏡對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖6所示。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞，紅色熒光為PI染色陽性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細(xì)胞，未被熒光染色的為正常細(xì)胞。NC組Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度非常弱，表明PC12細(xì)胞處于正常狀態(tài);模型組熒光強(qiáng)度明高于NC組，表明CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞死亡。CL、CM以及CH組熒光強(qiáng)度逐漸降低，細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，表明西紅花能夠較為有效的抑制CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

2.7?Caspase-3活性檢測(cè)?Caspase是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族，Caspase-3是其中一個(gè)關(guān)鍵酶，其介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。通過檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的Caspase-3活性可以反映細(xì)胞凋亡程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常組Caspase-3活性為（7.05±0.12）μmol/L，模型組為（15.48±0.48）μmol/L，CL組為（10.86±0.79）μmol/L，CM組為（8.90±0.15）μmol/L，CH組為（7.62±0.83）μmol/L。測(cè)定結(jié)果顯示，CORT損傷組與對(duì)照組比，Caspase-3活性顯著升高（**P<0.01）;藥物保護(hù)組與模型組比顯著降低（△P<0.05），結(jié)果見圖7。

3?討論

西紅花的主要成分為西紅花苷-I、藏花醛和山柰酚等[12]。研究表明，其具有抗氧化活性和神經(jīng)保護(hù)作用[13]。并且有Meta分析得出結(jié)論，補(bǔ)充服用西紅花可以改善輕度至中度抑郁癥患者的臨床癥狀[14]。但其起效的生物過程和細(xì)胞體外抑郁模型的保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。因此，在本研究中，我們使用CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，構(gòu)建抑郁癥體外模型，通過檢測(cè)細(xì)胞存活率、LDH釋放率、Annexin V-FITC/PI雙染色法和Caspase-3活性，探討西紅花對(duì)CORT致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞，具有類似于神經(jīng)細(xì)胞的一般特征[15]。由于PC12細(xì)胞具有易獲取、可傳代、增殖迅速等優(yōu)點(diǎn)，使其在抑郁癥研究中應(yīng)用廣泛[16]。CORT是一種糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GC），是HPA軸（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPA）的終末產(chǎn)物，CORT濃度增加可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，產(chǎn)生抑郁樣行為[17]。因此高濃度CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型廣泛應(yīng)用于抑郁的體外實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)觀察到，CORT對(duì)PC12細(xì)胞有明顯的損傷作用，呈劑量依賴性。500 μmol/L CORT損傷24 h，細(xì)胞存活率下降到（49.54±1.82）%，且穩(wěn)定可重復(fù)，因此選用此濃度作為該實(shí)驗(yàn)損傷模型。2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL西紅花預(yù)處理細(xì)胞，造模后檢測(cè)細(xì)胞存活率，分別為（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選為藥物保護(hù)的模型濃度。

本研究探討了西紅花對(duì)CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，西紅花可提高損傷后細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞膜損傷的LDH釋放量，且能夠明顯減少PC12細(xì)胞凋亡及死亡數(shù)量。通過倒置顯微鏡和Annexin V-FITC/PI雙染色法于熒光顯微鏡下觀察，CORT造模后，PC12細(xì)胞出現(xiàn)突觸收縮、折光性差、細(xì)胞膜粗糙等損傷及凋亡典型特征，加入西紅花處理后，其上述特征及凋亡熒光明顯減少。說明了西紅花對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡具有一定的改善作用。Caspase-3是凋亡領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，它是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終通路，活化的Caspase-3切割下游相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮促凋亡作用。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，體內(nèi)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間協(xié)同作用，共同決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3活性明顯升高，西紅花進(jìn)行干預(yù)后，Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯減少，這些說明了CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡可能與Caspase-3依賴的凋亡通路有關(guān)，西紅花可抑制該凋亡蛋白的表達(dá)。綜上表明西紅花能夠有效的保護(hù)CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷。但西紅花抗抑郁的物質(zhì)基礎(chǔ)和更為確切的分子機(jī)制及信號(hào)通路并還尚未明確，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)

[1]Betteridge DJ，Gibson JM，Sager PT.Comparison of effectiveness of rosuvastatin versus atorvastatin on the achievement of combined C-reactive protein（<2 mg/L）and low-density lipoprotein cholesterol（<70 mg/dl）targets in patients with type 2 diabetes mellitus（from the ANDROMEDA study）[J].Am J Cardiol，2007，100（8）：1245-1248.

[2]Niculescu AB，Akiskal HS.Proposed endophenotypes of dysthymia：evolutionary，clinical and pharmacogenomic considerations[J].Mol Psychiatry，2001，6（4）：363-366.

[3]Sansone RA，Sansone LA.Dysthymic disorder：forlorn and overlooked？[J].Psychiatry（Edgmont），2009，6（5）：46-51.

[4]范毅.選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2012，35（2）：126-129.

[5]張英，崔向麗，楊萍，等.SSRI和SNRI類抗抑郁藥的不良反應(yīng)[J].中國(guó)藥物警戒，2010，7（9）：554-556.

[6]彭海君.西紅花生物學(xué)特性、離體快繁及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2014.

[7]柯櫻，安泳潼，趙亞紅.西紅花治療精神疾病研究進(jìn)展及作用機(jī)制探討[J].上海中醫(yī)藥雜志，2016，50（11）：95-101.

[8]陳建麗.復(fù)方柴歸方對(duì)皮質(zhì)酮致低分化PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D].太原：山西大學(xué)，2016.

[9]林玲，劉國(guó)良，孫縵利.西紅花苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（13）：2420-2424.

[10]孔艷，羅濤，蔣威，等.西紅花酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].解剖學(xué)研究，2012，34（5）：358-363.

[11]周本宏，吳麗寧，沈恒，等.天麻多糖對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥師，2012，15（5）：595-598.

[12]張留記，劉欽松，屠萬倩，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（7）：630-632.

[13]彭海君.西紅花生物學(xué)特性、離體快繁及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2014.

[14]Hausenblas HA，Saha D，Dubyak PJ，et al.Saffron（Crocus sativus L.）and major depressive disorder：a meta-analysis of randomized clinical trials[J].Journal of Integrative Medicine，2013，11（6）：377-383.

[15]何小燕，陳建麗，向歡，等.谷氨酸和皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12抑郁癥細(xì)胞模型差異性的～1H NMR代謝組學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（2）：245-252.

[16]Mao QQ，Zhong XM，F(xiàn)eng CR，et al.Protective effects of paeoniflorin against glutamate-induced neurotoxicity in PC12 cells via antioxidant mechanisms and Ca2+ antagonism[J].Cell Mol Neurobiol，2010，30（7）：1059-1066.

[17]Monaghan DT，Bridges RJ，Cotman CW.The excitatory amino acid receptors：their classes，pharmacology，and distinct properties in the function of the central nervous system[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，1989，29（1）：365-402.