覃靜林 張靜 張軍民

【關(guān)鍵詞】 Fonsecaea monophora;色素;人巨噬細(xì)胞;THP-1單核細(xì)胞;炎癥細(xì)胞因子

Effect of Fonsecaea monophora pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages Qin Jinglin， Zhang Jing， Zhang Junmin. Department of Dermatology， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhang Junmin， E-mail： junminmx@ 163. com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of Fonsecaea monophora （F. monophora） pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages. ?Methods THP-1 human monocytes were induced into macrophages and co-cultured with the standard， pigment and albino strains of F. monophora. The expression levels of CD14 and CD68 on the cell membrane surface were quantitatively detected by immunofluorescence. Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of IL-1β，TNF-α， IL-6， IL-10 and TGF-β in each group. ?Results After the induction of THP-1 human mononuclear cells into macrophages， the expressed membrane surface molecule was changed from CD14 to CD68. After co-culture with F. monophora， the expression levels of IL-6， IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain （all P < 0.05）. The expression of IL-6 and TGF-β was remarkably up-regulated in the pigment strain （both P < 0.05）. The expression levels of IL-1β， TNF-α， IL-6 and IL-10 were significantly up-regulated in the albino strain （all P < 0.05）. The expression of IL-1β in the albino strain was significantly higher than that in the standard strain （P < 0.05）. The expression levels of IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain compared with those in the pigment and albino strains （all P < 0.05）. ?Conclusions The standard strain of F.monophora can promote the development of human macrophages into the anti-inflammatory state. The albino strain can accelerate the progression of human macrophages into the pro-inflammatory state， whereas the pigment strain can maintain human macrophages in the balance state between pro-inflammatory and anti-inflammatory state， indicating that F. monophora pigment may lead to the disorder of inflammatory state of the host.

【Key words】 Fonsecaea monophora;Pigment;Human macrophage;THP-1 monocyte;

Inflammatory cytokine

著色芽生菌?。–BM）由暗色孢科中的一組特殊暗色真菌導(dǎo)致的一種慢性進(jìn)行性皮膚和皮下組織肉芽腫性真菌病，是最常見的植入性真菌感染病之一。病原菌通過皮膚破損處進(jìn)入宿主體內(nèi)，最常發(fā)生于下肢，多發(fā)于從事農(nóng)、林及畜牧業(yè)的體力勞動者。該病進(jìn)展緩慢，病程可達(dá)數(shù)十年，治療困難且易復(fù)發(fā)，部分患者發(fā)病部位可以發(fā)生癌變，使患者喪失工作能力甚至威脅患者生命，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。該病于2017年被世界衛(wèi)生組織正式納入“被忽略的熱帶病”范疇，以此呼吁全球?qū)＜抑匾昜1]。在我國，CBM發(fā)生地域主要位于山東及兩廣地區(qū)[2-3]。很多研究表明CBM的重要致病因子是黑色素、硬殼細(xì)胞、細(xì)胞黏附性和疏水性[1]。

Fonsecaea monophora（F. monophora）是從多株F. pedrosoi著色霉菌株中發(fā)現(xiàn)的一個新種，是我國南方地區(qū)CBM的主要致病菌[4-5]。該菌不僅可以造成局限性皮膚感染，也可引起系統(tǒng)性感染，侵犯神經(jīng)系統(tǒng)或呼吸道，具有噬神經(jīng)性，正如隱球菌一樣，嚴(yán)重者危及患者的生命健康[6-7]。盡管很多學(xué)者致力于CBM發(fā)病機制的研究，但到目前為止，F(xiàn).monophora的致病機制并不十分清楚。

在不同的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可被刺激產(chǎn)生不同的炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)處于促炎狀態(tài)時，可分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎癥細(xì)胞因子，清除和殺傷入侵的病原菌，抑制周圍細(xì)胞的增殖和破壞組織的完整性，當(dāng)處于抗炎狀態(tài)時，可分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎癥和促修復(fù)細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和組織修復(fù)，導(dǎo)致疾病慢性化[8-9]。以往的相關(guān)體外研究大多數(shù)是在小鼠巨噬細(xì)胞層面進(jìn)行。然而，F(xiàn). monophora對人巨噬細(xì)胞的影響，尤其是F. monophora色素對人巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，暫未見文獻(xiàn)報道。

材料與方法

一、細(xì)胞和菌株

人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典藏物保存中心。F.monophora標(biāo)準(zhǔn)株（CBS269.37，SUMS0310）受贈于荷蘭微生物菌種保藏中心，既有孢子成分又有菌絲成分，含色素;F. monophora 色素株（CBS122845，SUMS0505）分離自一位81歲CBM患者的皮損，是一種分生孢子突變株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列鑒定為F. monophora，含色素，無菌絲成分;F. monophora 白化株（CBS1 25149，SUMS0 510）是上述色素株在PDA培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種10余次后得到的天然突變株，不含色素，無菌絲成分。

二、主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） （BD，美國）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco， 美國）;青霉素/

鏈霉素混合液（雙抗）（Hyclone， 美國）;胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）（Gibco， 美國）; PBS緩沖液（1×）（Gibco， 美國）;丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）（Sigma， 美國）;6孔板細(xì)胞爬片（廣州永津生物科技有限公司）;抗CD14抗體（Servicebio， 中國）;抗CD68抗體（Servicebio， 中國）;Trizol RNA提取試劑（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）;TB GreenTM ?Premix Ex TaqTM ?Ⅱ（TaKaRa， 大連寶生物工程有限公司）;PrimeScriptTM RTMaster Mix（TaKaRa， 大連寶生物工程有限公司）。

三、實驗方法

1. 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng)

在無菌超凈臺內(nèi)，無菌操作復(fù)蘇THP-1細(xì)胞株，用提前配置好的含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～ 3 d。經(jīng)2 ～ 3次傳代狀態(tài)穩(wěn)定后用Count Star細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度至6×105 /ml，轉(zhuǎn)至6孔板。

2. 細(xì)胞免疫熒光

將實驗分為2組：THP-1空白對照組和THP-1+PMA實驗組，將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105 /ml，轉(zhuǎn)種至鋪好細(xì)胞爬片的6孔板中，每孔2 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共孵育48 h?？瞻讓φ战M則將濃度為6×105 /ml的細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞爬片上，超凈臺內(nèi)風(fēng)干。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min;用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min;0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min;PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min;吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加稀釋好的一抗抗CD14（1∶300）和抗CD68（1∶500），并放入濕盒，4℃孵育過夜;PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗CY3-山羊抗小鼠（1∶300）和FITC-山羊抗兔（1∶500）（注意避光），濕盒中室溫孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min;滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI;用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

3. 制備F. monophora孢子懸液

將3種F. monophora分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)13 ～ 15 d后，用PBS緩沖液反復(fù)輕輕吹打菌落，制備菌懸液。以10 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，去上清，重復(fù)2次，PBS緩沖液重懸，血球計數(shù)板調(diào)整菌懸液的分生孢子濃度為6×107 CFU/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 實驗分組及共培養(yǎng)的建立

將實驗分為4個組：空白對照組、標(biāo)準(zhǔn)株組、色素株組和白化株組。細(xì)胞傳代2 ～ 3次，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105 /ml，轉(zhuǎn)種到6孔板，每孔1.8 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共孵育6 h待細(xì)胞完全貼壁后以細(xì)胞∶孢子=1∶10的比例每孔加入提前配置好的菌懸液200 μl，在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)42 h[10]。

5. 細(xì)胞和F. monophora觀察

F. monophora與細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后于相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞和F. monophora的變化并拍照記錄。

6. 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR

總RNA提取按照試劑說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR反應(yīng)均依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min;95℃變性 5 s，60℃擴(kuò)增15 s并采集熒光信號，45個循環(huán)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

以上實驗均重復(fù)3次，定量PCR結(jié)果由Bio-Rad CFX Connect PCR擴(kuò)增儀收集。PCR循環(huán)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析，以檢驗PCR反應(yīng)的特異性。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用進(jìn)階相對定量（advanced relative quant-ification）方法對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行分析，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，以2-△△Ct法分析進(jìn)行組間相對定量分析。使用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PMA可將THP-1人單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞

在加入PMA誘導(dǎo)6 h后，細(xì)胞由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁狀態(tài);與未被誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)吞噬泡增大增多，隨著共孵育時間的延長，形態(tài)不再呈圓形，而是多邊形，甚至出現(xiàn)觸角。細(xì)胞膜表面分子由單核細(xì)胞高表達(dá)的CD14轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞高表達(dá)的CD68（圖1）。

二、F. monophora 不同菌株對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

標(biāo)準(zhǔn)株與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后，可以觀察到孢子的繼續(xù)生長繁殖并沒有受到明顯的影響，但同時可以觀察到部分菌絲被巨噬細(xì)胞所包裹（圖2B）;色素株和白化株與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后，可以發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞聚集在孢子的周圍，標(biāo)準(zhǔn)株的小孢子可被吞噬，但菌絲不可被吞噬;色素株和白化株的孢子由于體積較大，粘連成團(tuán)，不能被吞噬（圖2C、D）。

三、F. monophora色素對THP-1來源人巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

F. monophora標(biāo)準(zhǔn)株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為4.515、9.458、12.630，P均< 0.05），對促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)有上調(diào)趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）;色素株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和抗炎細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為3.759、4.529，P均< 0.05），對促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)有上調(diào)趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）;白化株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)（LSD-t值分別為5.118、3.448、6.705、3.922，P均< 0.05），對抗炎細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)有上調(diào)趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。白化株較標(biāo)準(zhǔn)株能上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)（LSD-t=3.807，P < 0.05）;標(biāo)準(zhǔn)株較色素株和白化株能上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為5.815、4.952、7.249、9.848，P均< 0.05），見圖3。

討 論

真菌細(xì)胞壁是真菌生存和致病的重要結(jié)構(gòu)，包括葡聚糖、甘露糖、色素等成分，色素在細(xì)胞壁層形成不規(guī)則顆粒，通過與含甘露糖或葡聚糖的糖蛋白間形成共價鏈接而錨定在細(xì)胞壁上[11]。許多文獻(xiàn)證實色素是真菌的重要毒力因子，參與調(diào)節(jié)宿主與真菌的免疫炎癥反應(yīng)。色素對宿主免疫的影響涉及炎癥細(xì)胞遷移、吞噬、凋亡等多方面。很多研究證實了巨噬細(xì)胞在真菌色素-宿主相互作用中的重要性。煙曲霉色素通過改變巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬體的pH值阻止其凋亡，而無色素變異株則不能修正這種pH值的變化，致使吞噬體在持續(xù)酸性環(huán)境里最終進(jìn)入死亡階段[12]。煙曲霉色素除了能屏蔽β葡聚糖從而影響病原分子模式識別外，還能通過移除細(xì)胞吞噬體內(nèi)NAPDH氧化酶的亞單位、抑制NADPH氧化酶活性而抑制人單核細(xì)胞發(fā)生與LC3相關(guān)的自噬[13]。

真菌的色素除了抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬細(xì)胞的酸化、中性粒細(xì)胞遷移等免疫反應(yīng)外，近期Rambach等（2015年）證實色素還有促進(jìn)血小板活化、誘導(dǎo)顆粒釋放等作用。F. pedrosoi色素被證實能夠刺激IL-10分泌，并可下調(diào)宿主細(xì)胞吞噬率，推測色素可能是調(diào)節(jié)宿主免疫類型、形成維持感染的主要原因。研究表明F. monophora色素株及其細(xì)胞壁成分可以降低小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的表達(dá)，抑制一氧化氮在體外的合成，Th2細(xì)胞因子的表達(dá)增加，Th1細(xì)胞因子的表達(dá)被抑制，表明黑色素在體外避免氧化殺傷的過程中起著重要作用，Th2細(xì)胞因子的表達(dá)增加可能會加速真菌的持續(xù)存在[14]。此外，F(xiàn). monophora 色素能夠刺激BALB/c小鼠Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)Th1細(xì)胞因子的分泌，色素的存在對BALB/c小鼠產(chǎn)生的毒力較強，從而推測黑色素是F.monophora重要的毒力因子和保護(hù)因子[15]。在我們的研究中，F(xiàn). monophora與THP-1來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，白化株較標(biāo)準(zhǔn)株能明顯上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)株較色素株和白化株能明顯上調(diào)抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。F. monophora標(biāo)準(zhǔn)株由于既含有色素又有菌絲成分，其毒力更強，能促使人巨噬細(xì)胞往抗炎狀態(tài)發(fā)展，抑制宿主對病原菌的清除和殺傷，白化株不含色素，毒力較弱，能促使人巨噬細(xì)胞往促炎狀態(tài)發(fā)展，色素株則使人巨噬細(xì)胞處于促炎和抗炎的平衡狀態(tài)，既不利于早期入侵宿主病原體的清除，也不利于宿主的后期修復(fù)。

綜上所述，我們的研究初步表明F. monophora色素在人細(xì)胞水平上的毒力表現(xiàn)與鼠科水平基本一致。所以利用THP-1人單核細(xì)胞系來研究F. monophora的致病機制是可行的。同時，本研究首次成功構(gòu)建了F. monophora不同菌株與THP-1來源的人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，可為后續(xù)在人類細(xì)胞水平上進(jìn)一步闡明CBM的發(fā)病機制及F. monophora 的致病機制和宿主防御機制奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Queiroz-Telles F， de Hoog S， Santos DW， Salgado CG， Vicente VA， Bonifaz A， Roilides E， Xi L， Azevedo CM， da Silva MB， Pana ZD， Colombo AL， Walsh TJ. Chromoblastomycosis. Clin Microbiol Rev，2017，30（1）：233-276.

[2] Lu S， Lu C， Zhang J， Hu Y， Li X， Xi L. Chromoblastomycosis in Mainland China： a systematic review on clinical charac-teristics. Mycopathologia，2013，175（5-6）：489-495.

[3] Fransisca C， He Y， Chen Z， Liu H， Xi L. Molecular identifi-cation of chromoblastomycosis clinical isolates in Guang-dong. Med Mycol，2017，55（8）：896.

[4] Ameen M. Chromoblastomycosis： clinical presentation and management. Clin Exp Dermatol，2009，34（8）：849-854.

[5] Xi L， Lu C， Sun J， Li X， Liu H， Zhang J， Xie Z， De Hoog GS. Chromoblastomycosis caused by a meristematic mutant of Fonsecaea monophora. Med Mycol，2009，47（1）：77-80.

[6] 陳少瓊，全力，張志剛，鄺思馳，陳俊偉，郭月飛. 隱球菌性顱內(nèi)腫塊性病變磁共振成像的特征性表現(xiàn). 新醫(yī)學(xué)，2010，41（7）：451-454.

[7] Cleinman IB， Gon?alves SS， Nucci M， Quintella DC， Halpern M， Akiti T， Barreiros G， Colombo AL， Santoro-Lopes G. Respi-ratory tract infection caused by fonsecaea monophora after kidney transplantation. Mycopathologia，2017，182（11-12）：1101 ?1109.

[8] Verreck FA， de Boer T， Langenberg DM， Hoeve MA， Kramer M， Vaisberg E， Kastelein R， Kolk A， de Waal-Malefyt R， Ottenhoff TH. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert imm-unity to （myco）bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（13）：4560-4565.

[9] Martinez FO， Helming L， Gordon S. Alternative activation of macrophages： an immunologic functional perspective. Annu Rev Immunol，2009，27：451-483.

[10] 孫佳. 褐藻多糖對M2型巨噬細(xì)胞CCL2表達(dá)的影響與機制研究及外周血粒淋比作為腫瘤預(yù)后評價指標(biāo)的影響因素分析. 山東大學(xué)，2016.

[11] Gow N， Latge JP， Munro CA. The fungal cell wall： structure， biosynthesis， and function. Microbiol Spectr，2017，5（3）.

[12] Mohebbi S， Erfurth F， Hennersdorf P， Brakhage AA， Saluz HP. Hyperspectral imaging using intracellular spies： quantitative real-time measurement of intracellular parameters in vivo during interaction of the pathogenic fungus aspergillus fumigatus with human monocytes. PLoS One，2016，11（10）：e163505.

[13] Akoumianaki T， Kyrmizi I， Valsecchi I， Gresnigt MS， Samonis G， Drakos E， Boumpas D， Muszkieta L， Prevost MC， Kontoyiannis DP， Chavakis T， Netea MG， van de Veerdonk FL， Brakhage AA， El-Benna J， Beauvais A， Latge JP， Chamilos G. Aspergillus cell wall melanin blocks LC3-associated phagocytosis to promote pathogenicity. Cell Host Microbe，2016，19（1）：79-90.

[14] Zhang J， Wang L， Xi L， Huang H， Hu Y， Li X， Huang X， Lu S， Sun J. Melanin in a meristematic mutant of Fonsecaea monophora inhibits the production of nitric oxide and Th1 cytokines of Murine macrophages. Mycopathologia，2013，175（5-6）：515-522.

[15] Jiang M， Cai W， Zhang J， Xie T， Xi L， Li X， Sun J. Melanization of a meristematic mutant of Fonsecaea monophora increase the pathogenesis in a BALB/c mice infection model. Med Mycol，2018，56（8）：979-986.

（收稿日期：2019-01-12）

（本文編輯：楊江瑜）