楊勇　楊小生　李齊激　楊娟　鄧廷飛

摘 要：為提高淫羊藿藥渣中復(fù)合氨基酸的檢測(cè)分析準(zhǔn)確度，該試驗(yàn)對(duì)其復(fù)合氨基酸水解液進(jìn)行脫色工藝優(yōu)化。首先篩選最佳脫色劑，然后通過響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合氨基酸水解液脫色工藝條件，使水解液脫色率和氨基酸回收率最佳。通過篩選，AB-8大孔樹脂適合用于淫羊藿藥渣復(fù)合氨基酸水解液脫色，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳脫色工藝條件為：樹脂用量0.22 g，脫色時(shí)間27 min，脫色溫度24℃，經(jīng)驗(yàn)證，該條件下，水解液脫色率為79.05%，氨基酸回收率為90.88%。應(yīng)用響應(yīng)面法能優(yōu)化脫色工藝條件，用以滿足檢測(cè)分析的精度要求。

關(guān)鍵詞：淫羊藿藥渣;脫色;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：S38;R931

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）04-0065-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.04.012

Study on Decolorization Technology of Hydrolysate of Amino Acid Mixture from ?Epimedium ?Drug Residue

YANG Yong1，3，YANG Xiao-sheng2，LI Qi-ji2，YANG Juan2*，DENG Ting-fei2

（1.Pharmaceutical College，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang，Guizhou 550014，China;3.Beijing Youhekang Biomedical Technology Co. Ltd.，Beijing 100176，China）

Abstract：To improve accuracy of the detection and analysis of amino acid mixture in the ?Epimedium ?drug residue，the decolorization process for the hydrolysate of amino acid mixture was optimized in this study. Firstly，the optimum decolorizer was screened，and then the decolorization conditions for the hydrolysate of amino acid mixture were optimized by the response surface method to optimize the decolorization rate and the recovery rate of the amino acid mixture. AB-8 macroporous resin was suitable for the decolorization of amino acid hydrolysate. The optimum decolorization conditions were as follows： resin dosage，0.22 g; decolorization time，27 min; decolorization temperature，24℃. it was verified that under this condition，the decolorization rate of the hydrolyzate was 79.05%，and the amino acid recovery rate was 90.88%. The response surface method can be used to optimize the decolorization process conditions to meet the accuracy requirements of detection and analysis.

Key words： Epimedium ?drug residue; decolorization; response surface analysis

中藥渣作為一種植物源性廢料，仍含有氮、磷、鉀等植物生長(zhǎng)所必需的多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]。經(jīng)水提之后的淫羊藿藥渣剩余功能性成分很少被有效開發(fā)與利用，如黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)等。準(zhǔn)確分析其中的碳源、氮源有效成分的含量，以便于科學(xué)地開發(fā)與利用。

淫羊藿藥渣經(jīng)水解后，水解液中的色素對(duì)氨基酸的定性與定量分析均有嚴(yán)重的干擾[2]。因此，分析前應(yīng)進(jìn)行純化脫色。目前大多數(shù)研究都是基于活性炭脫色工藝的研究，利用響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂脫色工藝的研究報(bào)道較少。響應(yīng)面法在優(yōu)化反應(yīng)條件、研究多因素間相互作用的過程中較正交試驗(yàn)更直觀、連續(xù)、簡(jiǎn)便[3]。在脫色流程中，盡管活性炭脫色效果良好[4]，但氨基酸保留率較低，且脫色時(shí)間長(zhǎng)，難于過濾。而大孔樹脂具有理化穩(wěn)定性高、處理能力大、選擇性好、脫色時(shí)間短、解吸條件溫和及再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。但是，大孔樹脂脫色受環(huán)境因素影響較大[8]，在不同條件下，表現(xiàn)出不同的脫色效果以及對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的吸附性也不一樣，影響目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，需要嚴(yán)格控制脫色工藝條件，優(yōu)化脫色工藝條件，有利于提高大孔樹脂的脫色性能，同時(shí)提高目標(biāo)產(chǎn)物較高的回收率，對(duì)精確定量分析有重要意義。本試驗(yàn)首先通過篩選不同的脫色劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿藥渣中復(fù)合氨基酸水解液脫色工藝條件，確定合理的脫色工藝參數(shù)，以提高檢測(cè)淫羊藿藥渣氨基酸定量分析[9]的準(zhǔn)確度提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淫羊藿藥渣（貴州同濟(jì)堂制藥有限公司提供），活性炭（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），AB-8大孔樹脂、732強(qiáng)酸型大孔樹脂、122弱酸型大孔樹脂、330弱堿型大孔樹脂、硅藻土（陜西藍(lán)深特種樹脂有限公司），濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、茚三酮（2，2-二羥基二氫化茚-1，3-二酮）、氯化亞錫均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器（蘇州）有限公司），F(xiàn)E-20KpH計(jì)（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司），GZX-9023電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），GST25-20趕酸儀（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司），HH-4恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），SH2-88水浴恒溫振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合氨基酸水解液制備及脫色劑預(yù)處理

精密稱取干燥至恒重的淫羊藿藥渣粉末100.0 mg于水解管中，加6.0 mol/L濃鹽酸水解，冷凍，抽真空，充氮?dú)?，密封條件下110℃水解22～24小時(shí)[10]。趕酸[11]，減壓濃縮，底部留有少許固體或痕漬為止。加緩沖液溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容，作為供試品溶液。

活性炭、AB-8大孔樹脂、732型大孔樹脂、122型大孔樹脂、330型大孔樹脂、硅藻土的預(yù)處理方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]。

1.3.2 復(fù)合氨基酸水解液脫色率與回收率的計(jì)算

氨基酸的檢測(cè)采用茚三酮顯色法：取8支試管，分別量取100 mg/mL天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL，加蒸餾水稀釋至2.0 mL，加pH值為6.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液2.0 mL，最后每一管加2%茚三酮溶液[15]1.0 mL，搖勻。100℃水浴加熱15 min，于567 nm處測(cè)定吸光度[16]，平行測(cè)定三次。供試品同法操作測(cè)定吸光度。以氨基酸含量 x 為橫坐標(biāo)，以吸光度 y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 0.0185 x - 0.7901 ， r 2=0.9951 。氨基酸脫色率（ D ）與回收率（ R ）計(jì)算公式：

D （%）=（脫色前吸光度-脫色后吸光度）/ 脫色前吸光度×100%[17]

R （%）= 脫色后多糖含量（μg）/ 脫色前多糖含量（μg）×100%[18]

1.3.3 脫色劑篩選

靜態(tài)吸附法[19]：取5 mL供試品溶液置于25 mL具塞試管中，再加入適量預(yù)處理后的脫色劑，將各試管置于恒溫水浴振蕩箱中，30℃恒溫水浴振蕩60 min[20]，測(cè)定并計(jì)算溶液的脫色率和氨基酸回收率。

1.3.4 AB-8大孔樹脂脫色工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)考察：分別考察三個(gè)單因素[21]，即樹脂用量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g），脫色時(shí)間（20、30、40、50、60 min），脫色溫度（20、25、30、35、40℃）對(duì)供試品溶液脫色率和氨基酸回收率的影響。（2）響應(yīng)面法優(yōu)化脫色工藝：根據(jù)單因素考察的試驗(yàn)結(jié)果[22]，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心點(diǎn)組合試驗(yàn)，考察樹脂用量（A）、脫色時(shí)間（B）、脫色溫度（B）三個(gè)因素對(duì)水解液脫色率和回收率的綜合影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色劑的篩選

由圖1可看出，活性炭的脫色率最高，122弱酸型陽離子交換樹脂的氨基酸回收率最高，而AB-8大孔樹脂在保證較高的脫色率（66.82%）的條件下，氨基酸回收率（90.54%）仍然很高。因此，本試驗(yàn)使用AB-8大孔樹脂作為淫羊藿藥渣復(fù)合氨基酸水解液的脫色劑。

2.2 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果

由圖2可知，隨著大孔樹脂用量的增加，水解液脫色率逐漸升高，氨基酸回收率逐漸降低，樹脂用量在0.1～0.3 g范圍內(nèi)，水解液脫色率有顯著升高的趨勢(shì)，同時(shí)氨基酸回收率降低趨勢(shì)不明顯，因此，應(yīng)用響應(yīng)面法篩選的樹脂用量的梯度范圍為0.1～0.3 g;由圖3可知，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液脫色率逐漸升高，氨基酸回收率逐漸降低，脫色時(shí)間在20～40 min范圍內(nèi)，水解液脫色率有顯著升高的趨勢(shì)，同時(shí)氨基酸回收率降低趨勢(shì)不明顯，因此，應(yīng)用響應(yīng)面法篩選的脫色時(shí)間梯度范圍為20～40 min;由圖4可知，隨著脫色溫度的升高，水解脫色率逐漸降低，氨基酸回收率略有升高，脫色溫度在20～30℃范圍內(nèi)，水解液脫色率降低趨勢(shì)不明顯，同時(shí)氨基酸回收率仍然處于很高水平，因此，應(yīng)用響應(yīng)面法篩選的脫色溫度梯度范圍為20 ～ 30℃。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，分別得到脫色率回歸方程與回收率回歸方程：

脫色率（%）= 77.87 + 5.67 A - 3.05 B - 3.43 C - 6.36 AB + 2.58 AC + 0.22 BC - 22.04 A2 - 7.37 B2 - 10.08 C2，該方程R2 = 0.9991;

回收率（%）= 89.94 + 5.83 A - 3.29 B - 5.61 C - 4.33 AB - 5.37 AC - 3.00 BC - 15.47 A2- 10.73 B2 - 11.64 C2，該方程R2 = 0.9997。這兩個(gè)方程的相關(guān)系數(shù)表明，回歸分析方程的可信度較好[23]，能夠分析和預(yù)測(cè)優(yōu)化后的脫色率和回收率。脫色率回歸方程的分析結(jié)果表明，該模型的F值為1172.38，且 P <0.001（表明該模型具有極顯著性差異），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與純誤差正相關(guān)的失擬項(xiàng)的F值為2.84，不顯著（ P >0.05），說明該方法與實(shí)際試驗(yàn)差異較小，擬合程度較好[24]，脫色率預(yù)測(cè)值能符合實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果。脫色率的回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，樹脂用量（A）、脫色時(shí)間（B）、脫色溫度（C）三個(gè)因素均對(duì)響應(yīng)值脫色率有極顯著影響，三個(gè)因素的影響程度由大到小依次為：A > C > B，且A與B、A與C之間存在一定程度交聯(lián)影響，但B與C之間無交聯(lián)影響;回收率回歸方程的分析結(jié)果同樣表明，該模型的F值為3342.61，且 P < 0.001（表明該模型具有極顯著性差異），該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與純誤差正相關(guān)的失擬項(xiàng)的F值為4.33，不顯著（ P >0.05），說明該方法與實(shí)際試驗(yàn)差異較小，擬合程度較好，回收率預(yù)測(cè)值能符合實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果。回收率的回歸方程各項(xiàng)方程分析結(jié)果表明，A、B、C三個(gè)因素均對(duì)響應(yīng)值脫色率有極顯著影響，三個(gè)因素的影響程度由大到小依次為：A > C > B，且A與B、A與C、B與C之間均存在一定程度交聯(lián)影響。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳脫色工藝條件為：樹脂用量0.22 g，脫色時(shí)間27.12 min，脫色溫度24.07℃，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，將該條件調(diào)整為：樹脂用量0.22 g，脫色時(shí)間27 min，脫色溫度24℃。經(jīng)過5次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，該條件下水解液的脫色率平均值為79.05%，氨基酸回收率的平均值為90.88%。因此，證明通過響應(yīng)面法能優(yōu)化復(fù)合氨基酸水解液的脫色工藝條件，同時(shí)能較好地分析與預(yù)測(cè)最終試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合氨基酸水解液脫色工藝條件，通過考察樹脂用量、脫色時(shí)間、脫色溫度三個(gè)因素對(duì)該試樣脫色率和回收率的影響，結(jié)果表明，三個(gè)因素均能對(duì)水解液脫色率和氨基酸回收率產(chǎn)生極顯著影響，且影響程度大小均為：樹脂用量 > 脫色溫度 > 脫色時(shí)間。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳脫色工藝條件為：樹脂用量0.22 g，脫色時(shí)間27 min，脫色溫度24℃。經(jīng)驗(yàn)證，該條件下，水解液脫色率為79.05%，氨基酸回收率為90.88%，與模型預(yù)測(cè)值接近，很好地證明了該模型的可靠性。

大多數(shù)常見氨基酸的等電點(diǎn)范圍是5～7[25]，將復(fù)合氨基酸緩沖溶液的pH值控制在8～ 10，使這些氨基酸的極性增強(qiáng)，能提高其溶解度。該試驗(yàn)中選取弱極性的AB-8大孔樹脂作為脫色劑，因?yàn)槠淠苓x擇性吸附弱極性有色物質(zhì)，而達(dá)到脫色的目的，同時(shí)最大程度地保留目標(biāo)產(chǎn)物，但是仍然有少部分等電點(diǎn)大于7的氨基酸會(huì)被樹脂吸附而損失掉，如賴氨酸、精氨酸、組氨酸。當(dāng)AB-8大孔樹脂用量過多，也會(huì)造成目標(biāo)產(chǎn)品損失過多;另一方面，AB-8大孔樹脂在高溫的條件下，容易發(fā)生解吸附，造成脫色率下降，因此，控制好樹脂用量與脫色溫度是進(jìn)行該項(xiàng)研究的關(guān)鍵。該試驗(yàn)對(duì)復(fù)合氨基酸水解液脫色工藝優(yōu)化，能優(yōu)化該試樣的純化工藝流程，便于建立高效快捷的檢測(cè)分析方法，為此提供可行參考依據(jù)。

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