白玉琢　徐菁　陳潔　張佳怡　許玥　魯曼　李欣怡　霍澤軍　張莉

〔摘要〕 目的 探討多裂肌損傷后，電針“委中”干預(yù)對多裂肌損傷過程中鈣調(diào)蛋白信號通路的影響。方法 SD大鼠隨機分為空白組、模型1 d組、模型3 d組、電針1 d組、電針3 d組，每組8只。電針組雙側(cè)“委中”電針，于治療的第1、3天各組同步取材，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測多裂肌、脊髓、海馬組織中CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量。結(jié)果 模型1 d和3 d組，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ含量顯著高于空白組（P<0.01）;多裂肌、脊髓、海馬iNOS含量高于空白組（P<0.05或P<0.01）。電針1 d后，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量顯著低于模型1 d組（P<0.05或P<0.01）。電針3 d后，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量低于模型3 d組（P<0.05或P<0.01）。電針3 d后，脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ及多裂肌CaMKⅡ含量顯著低于電針1 d組（P<0.01），多裂肌CaM、iNOS和脊髓、海馬iNOS含量與電針1 d組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 多裂肌損傷早期，電針“委中”干預(yù)可通過抑制CaM、CaMKⅡ的過度激活，減少組織中iNOS的過多產(chǎn)生，減輕組織炎癥損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 多裂肌;脊髓;電針;委中;海馬;鈣調(diào)蛋白

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.014

Effects of Electroacupuncture Weizhong （BL40） on Calmodulin Signaling Pathway in Rat

Model of Multifidus Injury

BAI Yuzhuo1， XU Jing1， CHEN Jie1， ZHANG Jiayi1， XU Yue1， LU Man1， LI Xinyi1， HUO Zejun2*， ZHANG Li1*

（1. School of Acupuncture， Moxibustion and Tuina， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Department of Traditional Chinese Medicine， Peking University Third Hospital， Beijing 100191， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of electroacupuncture （EA） Weizhong （BL40） intervention on calmodulin signaling pathway in the process of multifidus muscle injury. Methods SD rats were randomly divided into the blank group， model 1d group， model 3d group， EA 1d group and EA 3d group， with 8 rats in each group. For the EA group， EA was performed at bilateral Weizhong （BL40）. Materials were collected on the first and third day of treatment among each group. The contents of CaM， CaMKII and iNOS in multifidus muscles， spinal cord and hippocampus were detected by ELISA. Results The contents of CaM and CaMK II in the hippocampus， spinal cord， hippocampus and multifidus muscles in the model 1d and 3d group were significantly higher than those in the blank group （P<0.01）， while the iNOS contents in the multifidus muscles， spinal cord and hippocampus were significantly higher than those in the blank group （P<0.05 or P<0.01）. After 1 day of EA， the contents of CaM， CaMKII and iNOS in the multifidus muscles， spinal cord and hippocampus were significantly lower than those in the model 1d group （P<0.05 or P<0.01）. After 3 days of EA， the contents of CaM， CaMKII and iNOS in the multifidus muscles， spinal cord and hippocampus were significantly lower than those in the model 3d group （P<0.05 or P<0.01）. After 3 days of EA， the contents of CaM， CaMKII in the spinal cord and hippocampus and the CaMKII in the multifidus muscles were significantly lower than those in the EA 1d group （P<0.01）. The contents of CaM and iNOS in multifidus muscles， and iNOS in the spinal cord and hippocampus were not significantly different when compared with EA 1d group （P>0.05）. Conclusion In the early stage of multifidus muscles injury， EA Weizhong （BL40） intervention can reduce the excessive activation of CaM and CaMK II， reduce the excessive production of iNOS in tissues， and alleviate tissue inflammation injury.

〔Keywords〕 multifidus muscle; spinal cord; electroacupuncture; Weizhong （BL40）; hippocampus; almodulin

鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）是廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)的一種鈣離子特異性蛋白，與細胞內(nèi)的鈣離子相結(jié)合后形成Ca2+-CaM復(fù)合物，激活下游的鈣調(diào)蛋白激酶CaMKⅡ，對細胞和機體的多種功能活動產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1]。既往研究證實Ca2+-CaM-CaMKⅡ信號通路在機體創(chuàng)傷中發(fā)揮重要作用，機體損傷后，往往伴有CaM、CaMKⅡ活性的降低和細胞炎癥的發(fā)生[2-5]。本研究選取局部注射布比卡因法制備大鼠多裂肌損傷模型，擬研究CaM-CaMKⅡ信號通路在多裂肌損傷中的作用，并闡釋電針“委中”干預(yù)對多裂肌損傷模型大鼠CaM-CaMKⅡ信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

本研究選取清潔級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為（280±20） g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證：SCXK（京）2016-0006]。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸機理實驗室，以普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20 ℃，濕度50%。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取8只作為空白組，剩余全部參與造模。本實驗動物的使用符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2? 造模方法

本實驗采用布比卡因鹽酸鹽（Sigma公司）多裂肌注射法制備腰多裂肌損傷大鼠模型，團隊前期通過多裂肌形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的病理改變觀察證實了模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性[6]。剩余大鼠稱取體質(zhì)量后按10%的水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，操作過程保持無菌。確定大鼠L4、L5棘突后使用4號一次性注射器抽取0.5%布比卡因溶液在L4-L5棘突水平的雙側(cè)的多裂肌處注射100 ？滋L。進針過程中保持針頭緊貼棘突骨面進入多裂肌，當(dāng)枕頭接觸到關(guān)節(jié)突和乳突所在骨面回抽無血則表明針頭已到達腰多裂肌注射點，注射時間應(yīng)大于等于3 s，以利于藥物的吸收。完成整個造模過程共注射4個點（L4、L5棘突水平左右各一點），每點注射100 ？滋L。

1.3? 分組及干預(yù)方式

空白組：8只，不做任何處理，只做觀察，與其它組大鼠同步取材。

模型組：造模后隨機抽取模型1 d組8只和模型3 d組8只，觀察完成后同步取材。

電針組：隨機抽取電針1 d組8只和電針3 d組8只。將大鼠俯臥固定后暴露后肢，選取雙側(cè)“委中穴”[7]（膝關(guān)節(jié)背面正中）針刺，接韓式電針儀 （HANS200A，北京思盛達醫(yī)療器械公司），2/100 Hz的疏密波，電流強度1～2 mA，持續(xù)20 min，1次/d。

每組分別在治療的第1、3天的時間點同步取材各8只。

1.4? 動物取材

各組大鼠稱取體質(zhì)量后以10%水合氯醛（350 mg/kg）行腹腔注射麻醉后取材。剔除大鼠背部皮毛、淺筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離豎脊肌和髂肋肌，銳性切除L4和L5節(jié)段多裂肌組織，取多裂肌置于4%多聚甲醛溶液中固定氮保存。冰盤上分離取出腰椎脊髓，液氮中保存，待測。斷頭取腦，冰盤上迅速分離取出海馬，液氮中保存，待測。

1.5? 指標(biāo)檢測

將備好的多裂肌組織、脊髓組織、海馬組織高速離心后的組織上清液按照1∶30倍的洗滌液用去離子水稀釋后攪拌均勻低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測多裂肌、脊髓、海馬組織中的CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量。

從試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，按照6 000～10 000 r/min高速離心30 s。取5個1.5 mL離心管（S5-S1）依次排列，各加入150 ？滋L樣本稀釋液，吸取150 ？滋L標(biāo)準(zhǔn)品到第1個離心管中（S5），輕輕混勻，從S5中吸取150 ？滋L到第2個離心管（S4），輕輕混勻，依次對標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。將各種試劑移至室溫（18～25 ℃）下平衡靜置30 min后按前述方法配制試劑，備用。分別設(shè)空白孔（空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50 ？滋L，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37 ℃溫育30 min后棄去液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，250 ？滋L/孔，甩干。每孔加酶標(biāo)試劑50 ？滋L，覆上新的板貼，37 ℃溫育30 min后棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 ？滋L/孔，甩干。每孔依序加入底物溶液A 50 ？滋L、底物溶液B 50 ？滋L，37 ℃避光顯色10 min。依序在每孔中加入終止液50 ？滋L，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)分析，計量資料進行正態(tài)性檢驗后，不同組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊性檢驗用LSD-t檢驗，方差不齊時用Welch檢驗，對于不符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。每組樣本數(shù)據(jù)用“x±s”表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠不同部位組織中CaM含量的比較

與空白組比較，其余4組多裂肌脊髓海馬中CaM的含量較之顯著升高（P<0.01）;與模型1 d組比較，電針1 d組、模型3 d組和電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaM的含量降低（P<0.05或P<0.01）;與模型3 d組比較，電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaM的含量降低（P<0.05或P<0.01）;與電針1 d組比較，電針3 d組多裂肌中CaM的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），脊髓和海馬中CaM的含量顯著降低（P<0.01）。見表1。

2.2? 各組大鼠不同部位組織中CaMKⅡ含量的比較

與空白組比較，模型1 d組、電針1 d組、模型3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaMKII的含量顯著升高（P<0.01），電針3 d組多裂肌、海馬中的CaMKII的含量升高（P<0.05），電針3 d組脊髓中CaMKII的含量較之升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型1 d組比較，電針1 d組、模型3 d組和電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaMKII的含量降低（P<0.05或P<0.01）;與模型3 d組比較，電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaMKII的含量降低（P<0.05）;與電針1 d組比較，電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中CaMKII的含量顯著降低（P<0.01）。見表2。

2.3? 各組大鼠不同部位組織中iNOS含量的比較

與空白組比較，模型1 d組和模型3 d組多裂肌、脊髓、海馬中iNOS的含量升高（P<0.05或P<0.01），電針1 d組和電針3 d組多裂肌中iNOS的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），電針1 d組脊髓、海馬中iNOS的含量顯著升高（P<0.01），電針3 d組脊髓中iNOS的含量升高（P<0.05），電針3 d組海馬中iNOS的含量升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型1 d組比較，電針1 d組、模型3 d組和電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中iNOS的含量降低（P<0.05或P<0.01）;與模型3 d組比較，電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中iNOS的含量降低（P<0.05或P<0.01）;與電針1 d組比較，電針3 d組多裂肌、脊髓、海馬中的iNOS的含量降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

Ca2+是生物體內(nèi)的經(jīng)典信使，與特定蛋白結(jié)合后參與細胞內(nèi)的諸多生化反應(yīng)[8]。CaM是細胞內(nèi)的與Ca2+結(jié)合的靶蛋白，與鈣離子結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物通過激活靶向酶CaMKⅡ而發(fā)揮生物活性作用[9]。既往研究[10-12]表明，Ca2+-CaM-CaMKⅡ通路也參與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。CaMKⅡ活性異?？善茐墓趋兰〖毎麅?nèi)的鈣離子平衡，導(dǎo)致骨骼肌細胞凋亡，最終引起骨骼肌損傷及功能異常。史丹丹等[13]使用大鼠脛骨前肌損傷模型驗證鈣調(diào)蛋白信號通路在骨骼肌炎癥中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脛骨前肌損傷急性期CaM呈現(xiàn)高水平表達，而在修復(fù)期CaM表達水平降低。曾林等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠咬肌疲勞模型中，骨骼肌細胞中的CaMKⅡ呈現(xiàn)高表達，且CaMKⅡ活性和細胞內(nèi)的鈣離子濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。劉佳琦、馬婧等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后鈣離子大量聚集于神經(jīng)元細胞內(nèi)與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，異常激活的CaMKⅡ通過啟動細胞內(nèi)凋亡程序以及氧化應(yīng)激反應(yīng)引起神經(jīng)元的損傷。NO是常見的炎癥細胞因子[17]，組織損傷過程中由iNOS誘導(dǎo)而大量產(chǎn)生，引起細胞的凋亡加重損傷[18]。

委中穴為足太陽膀胱經(jīng)的下合穴，是足太陽膀胱經(jīng)經(jīng)脈從腰背部循行至下肢后會合的部位，歷代醫(yī)家把委中穴作為針灸治療腰痛的特效穴[19]。根據(jù)2015年度發(fā)布的《腰痛針灸臨床實踐指南》，委中穴是臨床中針灸治療腰痛的首選穴位[20]。團隊前期研究[21-23]已經(jīng)證實，電針“委中”可通過調(diào)節(jié)生長因子IGF-1R、IGFBP3，促進骨骼肌細胞自噬，抑制骨骼肌炎癥因子IL-17等的過表達，對損傷的多裂肌修復(fù)緩解腰痛癥狀。

本研究采用局部注射布比卡因法制備了多裂肌損傷大鼠模型，從不同時間點觀察大鼠多裂肌、脊髓、海馬3個層次的的CaM、CaMKⅡ、iNOS活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在造模1 d和3 d后，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量顯著高于空白組（P<0.01），表明在骨骼肌急性損傷期，無論在損傷局部組織還是中樞脊髓、海馬等部位，均伴有CaM、CaMKⅡ、iNOS含量的升高。造模3 d后，由于機體開始啟動內(nèi)源性修復(fù)[24]，可見多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量較造模1 d后顯著降低（P<0.01）。電針“委中”干預(yù)1 d后，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量較造模1 d后顯著降低（P<0.05或P<0.01）。電針“委中”干預(yù)3 d后，多裂肌、脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ、iNOS含量較造模3 d后顯著降低（P<0.05或P<0.01）。電針“委中”干預(yù)3 d后，脊髓、海馬CaM、CaMKⅡ含量和多裂肌CaMKⅡ顯著低于電針干預(yù)1 d后（P<0.01）;而多裂肌、脊髓、海馬iNOS含量，電針干預(yù)3 d與電針干預(yù)1 d未見差異（P>0.05）。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，在布比卡因引起的大鼠多裂肌損傷模型中，CaM-CaMKⅡ通路不僅參與多裂肌局部損傷，同時參與脊髓和海馬等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，且在急性損傷期（造模后1 d）比較典型。在損傷早期，使用電針“委中”干預(yù)可通過抑制CaM、CaMKⅡ的過度激活，可減少組織中iNOS的過多產(chǎn)生，減輕組織炎癥損傷，而關(guān)于鈣調(diào)蛋白信號通路介導(dǎo)的多裂肌損傷后脊髓、海馬等中樞部位的病理過程及電針委中的干預(yù)機制則需要今后的深入研究做出解釋。

參考文獻

[1] 劉善慧，劉炳學(xué)，房澤岱.英漢藥理學(xué)辭典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1993：86-87.

[2] ANNA K， WOOKWANG J， JUNGJUN L， et al. Up-regulation of heme oxygenase-1 expression through CaMKII-ERK1/2-Nrf2 signaling mediates the anti-inflammatory effect of bisdemethoxycurcumin in LPS-stimulated macrophages[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2010，49（3）：323-331.

[3] WU H， KANATOUS S B， THURMOND F A， et al. Regulation of mitochondrial biogenesis in skeletal muscle by CaMK.[J]. Science， 2002，296（5566）： 349-352.

[4] FL？譈CK M， WAXHAM M N， HAMILTON M T， et al. Skeletal muscle Ca2+-independent kinase activity increases during either hypertrophy or running[J]. Journal of Applied Physiology， 2000，88（1）：352.

[5] CHIN， EVA R. The role of calcium and calcium/calmodulin-dependent kinases in skeletal muscle plasticity and mitochondrial biogenesis[J]. Proceedings of the Nutrition Society， 2004，63（2）：279-286.

[6] 陳玉佩，劉? 通，鄒德輝，等.局部注射布比卡因建立大鼠骨骼肌損傷模型的組織形態(tài)學(xué)評價[J].中國組織工程研究，2016，20（18）：2615-2621.

[7] 王春蘭，陳澤林，李桂蘭.常用實驗動物穴位的標(biāo)準(zhǔn)化定位方法研究[J].天津中醫(yī)藥，2016，33（2）：100-103.

[8] 寧? 鑫， 張? 艷.益氣活血復(fù)方對慢性心衰大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶及線粒體蛋白的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，

38（9）：37-40.

[9] PUROHIT A， ROKITA A G， GUAN X， et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation.[J]. Circulation， 2013，128（16）：1748-1757.

[10] CHEN W， KOOP A， LIU Y， et al. Reduced Threshold for Store-Overload-Induced-Ca2+-Release is a Common Defect of RyR1 Mutations Associated with Malignant Hyperthermia and Central Core Disease[J]. Biochemical Journal， 2017， 474（16）：2749-2751.

[11] ZHAO X， YAMAZAKI D， PARK K H， et al. Ca2+ Overload and Sarcoplasmic Reticulum Instability in tric-a Null Skeletal Muscle[J]. Journal of Biological Chemistry， 2010， 285（48）：37370-37376.

[12] EILERS W， JASPERS R T， HAAN A D， et al. CaMKII content affects contractile， but not mitochondrial， characteristics in regenerating skeletal muscle[J]. BMC Physiology， 2014（14）：7-15.

[13] 史丹丹，曹永英，曹? 標(biāo)，等.鈣調(diào)蛋白對骨骼肌炎癥的干擾效應(yīng)[J].免疫學(xué)雜志，2016，32（9）：756-761.

[14] 曾? 林，劉? 靜.咬合干擾大鼠咬肌線粒體鈣超載的離子變化特征及其鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的調(diào)節(jié)機制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018，

38（6）：755-760.

[15] 劉佳琦，李建民.顱腦損傷后鈣調(diào)節(jié)蛋白激酶活性的研究進展[J].華北理工大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，17（4）：73-75.

[16] 馬? 婧，劉曉莉，喬德才.鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在突觸可塑性和神經(jīng)精神疾病中的作用[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（11）：10-13.

[17] 葉意紅，劉秋佳，康樂薔薇，等.電針少陽經(jīng)特定穴對偏頭痛大鼠血清中NO、ET-1含量及50%PWT的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，38（12）：1453-1457.

[18] WANG K， BREMS J J， GAMELLI R L， et al. iNOS/NO signaling regulates apoptosis induced by glycochenodeoxycholate in hepatocytes[J]. Cellular Signalling， 2011， 23（10）：1677-1685.

[19] 封迎帥，劉百祥，張? 亮，等.電針環(huán)跳、委中穴對兔腰椎間盤突出癥的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，34（11）：53-56.

[20] 趙? 宏，劉志順，謝利民，等.《腰痛針灸臨床實踐指南》解讀[J].中國針灸，2015，35（10）：1065-1068.

[21] 盧宗孝，晏? 珺，于? 雪，等.多時間點觀察電針“委中”對大鼠腰多裂肌損傷后IGF1R和IGFBP3的表達[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（4）：954-958.

[22] 晏? 珺，盧宗孝，于? 雪，等.電針“委中”在大鼠腰多裂肌損傷修復(fù)過程中對自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2018，

11（2）：161-166.

[23] 鄒德輝，陳玉佩，劉? 通，等.電針“委中”對布比卡因致大鼠腰多裂肌損傷后形態(tài)學(xué)及CK、IL-17表達的影響[J].中國針灸，2017，37（9）：971-976.

[24] 彭園園，劉? 通，陳玉佩，等.電針“委中”對布比卡因致大鼠腰多裂肌損傷后再生及組織形態(tài)的影響[J].中國針灸，2016，36（3）：287-294.