王琮 楊少玲

[摘要]目的：證明BAG-1過表達(dá)與紫杉醇耐藥有關(guān)。方法：通過血清饑餓實(shí)驗(yàn)和DNAladder實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢上皮性癌對(duì)環(huán)境和紫杉醇反應(yīng)的差異;western=blot法檢測(cè)紫杉醇孵育24H后SKOV-3細(xì)胞BAG。1，BCL-XL和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：SKOV-3細(xì)胞對(duì)低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境或紫杉醇耐受能力較正常卵巢上皮細(xì)胞高;紫杉醇孵育24H后SKOV-3細(xì)胞BAG-1表達(dá)仍比卵巢上皮細(xì)胞高，BCL-2和BCL-XL仍有類似現(xiàn)象，但在所有濃度孵育下卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC和最高濃度孵育下的SKOV-3細(xì)胞未檢測(cè)BCL-2表達(dá)，DNA損傷標(biāo)記蛋白γH2AX表達(dá)在SKOV-3細(xì)胞中較卵巢上皮細(xì)胞低。結(jié)論：BAG-1在SKOV-3細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其作用機(jī)制與BCL-xL有關(guān)。

[中圖分類號(hào)]R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2019）05-008-01

1背景

來源于卵巢組織的惡性腫瘤是世界七大癌癥之一，每年新發(fā)病例中約有80%以上病例為Ⅲ期IV期，較早出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近二十年，卵巢癌發(fā)病率雖有所下降，死亡率卻是仍居高不下。隨著卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)廣泛應(yīng)用、紫杉醇等一線化療藥物的應(yīng)用及分子生物學(xué)手段日新月異，I期患者生存率有了顯著提高，五年生存率能達(dá)到90%左右。HI/IV期患者通常經(jīng)過約兩年時(shí)間治療，多數(shù)病例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥，因此五年存活率僅有25-30%。多步驟、多因素、多種關(guān)鍵分子或信號(hào)通路所致，通過影響卵巢癌細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。紫杉醇的引入是治療卵巢癌的重要里程碑。然而部分患者對(duì)紫杉醇反應(yīng)較差，這引起科研工作者對(duì)紫杉醇作用機(jī)制的深入研究，以改善患者生存率。

2材料和方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

卵巢上皮細(xì)胞HOSEplC，人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)（37℃，5%C02）培養(yǎng)。2-3.d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3卵巢癌細(xì)胞，卵巢上皮細(xì)胞HOSEplC用于本部分實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC均購(gòu)自于北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、HOSEplC細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3血清饑餓實(shí)驗(yàn) 使用不同濃度血清（10%，8%，6%，4%，2%，0%）對(duì)SKOV-3和HOSEpiC分別培養(yǎng)72.h，并使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

結(jié)果：如圖1所示，SKOV-3細(xì)胞在低濃度血清培養(yǎng)基中活性高于同濃度培養(yǎng)條件下的HOSEpiC。

2.4DNALadder檢測(cè)凋亡 結(jié)果：如圖2所示，（1）同濃度順鉑孵育后，HOSEplC細(xì)胞DNA斷裂較SKOV-3明顯;（2）HOSEplC和SKOV-3的DNA斷裂情況有紫杉醇劑量依賴性;（3）HOSEpiC細(xì)胞在最低紫杉醇濃度（1uM）孵育下較最高濃度（10uM）孵育的SKOV-3仍然有更強(qiáng)的DNA斷裂現(xiàn)象。

2.5順鉑作用后BAG-1與BCL-2蛋白家族表達(dá) 使用不同紫杉醇濃度孵育兩株細(xì)胞24.h，Western=Blot法檢測(cè)BAG-1、BCL-xL、BCL-2和磷酸化γH2AX表達(dá)水平。

3結(jié)果

如圖3所示，（1）24.h順鉑孵育后SKOV-3細(xì)胞BAG-1表達(dá)較所有濃度順鉑孵育下的HOSEplC表達(dá)水平高，其中BAG-1M在HOSEplC。中表達(dá)量極低;最高濃度順鉑孵育后SKOV-3細(xì)胞的BAG-1表達(dá)較其他濃度有所降低。但仍比HOSEpiC細(xì)胞表達(dá)量高;（2）BCL-xL在SKOV-3細(xì)胞表達(dá)隨順鉑濃度增加而表達(dá)增加，但在最高順鉑濃度組表達(dá)略有降低，BCL-xL蛋白在HOSEpiC細(xì)胞中隨順濃度增高略有降低;（3）在HOSEplC細(xì)胞中未檢測(cè)到BCL-2蛋白表達(dá)，在SKOV-3細(xì)胞中BCL-2表達(dá)隨順鉑濃度增加遞減，在最高順鉑濃度10uM未被檢測(cè)到;

（4）磷酸化γH2AX表達(dá)水平在HOSEpiC細(xì)胞中明顯高于同濃度順鉑孵育的SKOV-3細(xì)胞。

4討論

紫杉醇是各種癌癥化學(xué)治療的一線藥物，近年來卵巢癌靶向治療藥物發(fā)展迅速但仍需聯(lián)合紫杉醇治療。紫杉醇耐藥是影響HNSCC治療療效的最大障礙，本研究所選細(xì)胞的耐藥性通過體外低劑量紫杉醇誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此所選耐藥細(xì)胞更能體現(xiàn)臨床患者的實(shí)際情況，與其對(duì)應(yīng)原發(fā)腫瘤細(xì)胞比較更有價(jià)值。

對(duì)于紫杉醇耐藥機(jī)制已經(jīng)有諸多研究并找到許多生物標(biāo)記物，但是這些標(biāo)記物并不是在所有癌癥中表達(dá)，并且許多標(biāo)記物在紫杉醇耐藥中的作用顯示出相互矛盾的數(shù)據(jù)。迫其原因可能是因?yàn)樽仙即嫉淖饔脵C(jī)制與耐藥機(jī)制是多層次、多因素的，癌癥類型、分期、患者自身因素等導(dǎo)致不同的癌癥信號(hào)通路被激活。在一個(gè)患者中可能有多種耐藥機(jī)制激活，顯然一個(gè)生物標(biāo)記物對(duì)于癌癥的研究信息是不足夠。我們使用血清饑餓實(shí)驗(yàn)結(jié)合Westem Blot等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)得出BAG-1高表達(dá)可能是部分HNSCC患者產(chǎn)生順鉑耐藥性的重要原因。