何志清 漏佳偉 徐佳煬

摘要：甾體類藥物在臨床應用比較廣泛，僅次于抗生素類藥物，而這些不同結構的甾體藥物分子結構都是通過甾體激素中間體衍生的。甾體激素中間體傳統(tǒng)生產(chǎn)方式中包括化學合成和植物提取皂素法，這兩種生產(chǎn)方式不僅反應結構單一，需要消耗的成本高，同時還會對環(huán)境產(chǎn)生污染。所以必須要對甾體激素中間體的生產(chǎn)技術進行研究，本文主要以合成生物技術為例對生產(chǎn)甾體激素中間體的方式進行解讀，并對未來的發(fā)展趨勢進行展望。

關鍵詞：合成生物技術;甾體激素中間體;研究

甾體類藥物是一種含有環(huán)戊烷多氫菲母核結構的激素類藥物，比如常見的倍他米松、地塞米松等。甾體類藥物與抗生素是二十世紀藥物工業(yè)發(fā)展中的兩大突破，對治療呼吸系統(tǒng)、腫瘤以及內分泌等方面的疾病具有重要的作用。甾體類藥物每年的銷售量大，達到世界醫(yī)藥產(chǎn)品總額的10%。甾體類藥物生產(chǎn)中甾體激素中間體是一種應用比較廣泛的藥物形式，具有非常強大的市場需求，但是傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中成本高、產(chǎn)品單一以及生產(chǎn)污染等問題導致甾體類藥物的發(fā)展受到限制，所以還需要加強對甾體激素中間體生產(chǎn)技術的完善。

一、合成生物技術在甾體激素類中間體生產(chǎn)的解讀

（一）異戊二烯下游藥物生產(chǎn)

合成生物是以工程學思維為基礎的，設計和構建的新生物模塊、元件、系統(tǒng)或者一種天然系統(tǒng)的具有新功能、用途的，能夠滿足人類發(fā)展要求的生物技術。合成生物技術當前已經(jīng)被廣泛的應用到能源、環(huán)境和醫(yī)藥中，并取得了突破性的發(fā)展。當前已經(jīng)出現(xiàn)多種細胞異戊二烯基礎上的下游藥物生產(chǎn)模式。將異戊二烯焦磷酸作為前體分子，并通過聚合、降解以及修飾等方式合成多種萜烯類藥物，比如丹參酮、青蒿素、人參皂苷等，或者甾體激素類藥物，比如黃體酮。

在青蒿素的生產(chǎn)中以美國加州大學伯克利分校的Jay教授為領軍人物。Jay教授在2003年首次通過大腸桿菌表達青蒿素的克隆基因，并獲得青蒿二烯。2006年課題組又通過酵母素對青蒿二烯合成酶的基因進行導入，并通過P450氧化酶實現(xiàn)酶基因的還原，生產(chǎn)青蒿酸。2008年開始加強對青蒿酸酵母菌的優(yōu)化，通過發(fā)酵后獲得青蒿酸。以此為基礎，課題組還研究了人工蛋白支架，使大腸桿菌中不同的反應酶和分子數(shù)進行捆綁，通過協(xié)同作用對中間代謝物的積累進行有效的控制，提升產(chǎn)物的合成效率[1]。2009年通過基因來源的選擇替代工業(yè)發(fā)酵，提升青蒿二烯的生產(chǎn)效率。2013年又引入了5個外援反應酶以及輔助蛋白模塊，進一步提升青蒿酸的產(chǎn)量。

丹參酮是一種中藥提取物，具有良好的抗腫瘤作用，近年來得到廣泛的關注。2012年 科學院大連化學物理研究所以釀酒酵母為底盤細胞，構建模塊。通過表達tHMG1，以及BST1＼ERG20等，再一次提升丹參酮二烯的產(chǎn)量，同時通過發(fā)酵罐培養(yǎng)酵母工程菌，使產(chǎn)量翻番十幾倍。植物藥源在提取的過程中會導致物種資源破壞以及高污染等情況，形成嚴重的生態(tài)問題，所以還需要加強對新功能元件合成生物技術的開發(fā)和研究，逐漸由傳統(tǒng)天然提取的生產(chǎn)方式向微生物合成的方式進行轉變。

（二）甾體激素中間體底盤細胞的構建

人體以及動物體內的甾體激素分子主要的來源為膽固醇的合成，在膽固醇合成過程中中鯊烯到酵母固醇以及酵母中路徑一致，同時后期生產(chǎn)中酶的作用也基本相似，只有在末端生產(chǎn)過程中轉化為膽固醇或者麥角固醇。而釀酒酵母是代謝工程、基因工程等方面比較常用的一種菌株，操作更便捷，有利于大規(guī)模的培養(yǎng)和發(fā)酵，同時遺傳背景比較清晰，次生代謝產(chǎn)物單一，代謝的產(chǎn)物可以純化，實現(xiàn)核心蛋白的理想表達。所以最為固醇類的底盤細胞具有非常強的優(yōu)勢[2]。

德國柏林工業(yè)大學課題組對尿就酵母內源固醇生物合成途徑中涉及到的基因調控進行研究，并對tHMGR基因進行上調，提升酵母固醇前體物角鯊烯的產(chǎn)量。促進角鯊烯的固醇類物質轉化，該課題組還對羊毛固醇C-14去甲基化醇酶基因以及角鯊烯環(huán)氧酶基因進行表達，提升下游總固醇的產(chǎn)量。

（三）甾體激素中間體元件挖掘和檢驗構建

釀酒酵母底盤系統(tǒng)通過改造和優(yōu)化后，合成了分子類似物的外源膽固醇能力，通過人工路徑的設計，進一步合成甾體類分析。動物細胞通過對膽固醇側鏈的降解，剩余一個酮基反應，再通過細胞蘇媚以及蛋白鐵氧化與鐵氧還蛋白還原酶ADR合成。2009年該研究組通過HIP-CoA轉移酶基因與HIL-CoA脫氫酶基因失活反應，得到ADD、AD等重要的甾體中間體。并為其他微生物對甾體激素中間體的合成提供有效的思路，實現(xiàn)甾體激素藥物中間體工藝的多元化發(fā)展，對我國甾體植物源天然產(chǎn)物資源的開發(fā)和應用具有重要的意義。

二、合成生物技術在甾體激素中間體生產(chǎn)的應用展望

通過對基因原件包括核糖體結合位點、啟動子、終止子等根據(jù)工程化目標要求進行連接和重組就可以形成一個功能基因模塊。再通過對已有的生物網(wǎng)絡應用以及新功能基因模塊的引入等無法表達天然細胞合成，或者合成的產(chǎn)物量過低。雖然合成生物技術已經(jīng)出現(xiàn)新的方式和途徑，但是仍然處于初步的發(fā)展階段，生物合成路徑較長的物質酶反應還存在一定的不足，容易限制反應的發(fā)展，所以必須要對合成路徑進行進一步優(yōu)化，提升合成產(chǎn)量。

在甾體激素中間體的生產(chǎn)中通過合成生物技術的應用中最常見的底盤細胞為釀酒酵母，同時內源固醇是細胞膜結構合成的底物細胞，對代謝路徑的控制嚴格，但是通過對內源途徑的控制和改進仍然可以提升固醇含量的空間。此外，在固醇類代謝中脂肪酸合成是重要的途徑和方式，同時應用的前體主要為乙酰輔酶A，所以需要加強對乙酰輔酶A積累向內源固醇的轉化，而向脂肪酸的轉化，通過對這兩條代謝途徑的協(xié)調，為合成生物技術生產(chǎn)甾體激素中間體研究提供了重要的指導方向。

結語：

綜上所述，甾體激素中間體是甾體類藥物生產(chǎn)的關鍵原料，但是傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式中，由于產(chǎn)量低、成本高、污染嚴重等原因導致甾體類藥物生產(chǎn)受到嚴重的限制，所以還需要加強對合成生物技術的研究，提升甾體激素中間體的產(chǎn)量和效率，并降低成本，減少或者消除污染。

參考文獻：

[1]劉奪，張瑩，周曉，等.合成生物技術生產(chǎn)甾體激素中間體的研究展望[J].生命科學，2013，25（10）：958-965.

[2]邵明龍，張顯，徐美娟，等.全細胞轉化合成甾體激素類藥物中間體的研究[C].中國生物工程學會第十屆學術年會暨2016年全國生物技術大會論文集.江南大學，2016：1-3.