楊鑫柳 牛海濤 王清水 林堯

摘要：死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）是一種鈣離子/ 鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸/?蘇氨酸蛋白激酶，參與多種細(xì)胞進(jìn)程，如：自噬、凋亡和細(xì)胞遷移等。DAPK 作為一種抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。本文主要概述了 DAPK?的亞細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞器功能的影響。

關(guān)鍵詞：死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）;亞細(xì)胞定位;腫瘤

【中圖分類號(hào)】R329.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）05-024-03

1995?年，以色列學(xué)者 Deiss?等首次發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞凋亡正調(diào)控因子：死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated?protein kinase，DAPK）[1]。DAPK?是一種鈣離子 / 鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸 /?蘇氨酸蛋白激酶。作為一種抑癌基因，DAPK?參與了多種細(xì)胞進(jìn)程，如：自噬、凋亡和細(xì)胞遷移等 [2]，提高DAPK?的活性能夠?qū)е录?xì)胞出現(xiàn)死亡的特征，包括膜泡生成、細(xì)胞變圓、細(xì)胞外基質(zhì)脫離和自噬小泡的形成 [3]。研究發(fā)現(xiàn) 30%?膀胱癌、乳腺癌和腎細(xì)胞癌的細(xì)胞系及 70%β 細(xì)胞淋巴瘤和白血病細(xì)胞系中 DAPK?的 mRNA 與蛋白表達(dá)水平處于較低水平 ， 而 DAPK?在人和大鼠的組織中廣泛地表達(dá) [4]。DAPK?作為一個(gè)大分子蛋白質(zhì)，能夠參與細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的生理進(jìn)程，從而行使其抑癌基因的功能，本文就 DAPK?的亞細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞器功能的影響進(jìn)行綜述 。 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????1.DAPK?的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

DAPK 基因位于人類第 9 條染色體 q34.1， 轉(zhuǎn)錄成熟的

mRNA 為 5.9kb，編碼的蛋白分子量為 160Kd， 目前 DAPK 家族至少有 5 個(gè)成員：DAPK、DRP-1/DAPK2（ DAPK 相關(guān)蛋白 /DAPK- related protein kinase） 、DLK/ZIPK（ 死亡相關(guān)蛋白樣激酶 / 鏈接相互作用蛋白激酶 ， DAP like kinase/zipper interacting protein kinase） 、DRAK1（ DAPK 相關(guān)蛋白誘導(dǎo)激酶 1） 和 DRAK2 （ DAPK 相關(guān)蛋白誘導(dǎo)激酶 2）。五個(gè)成員的 C 端各不相同 [5]，但 DRP-1/DAPK2、DLK/ZIPK 和 DAP like kinase/zipper 的激酶區(qū)同 DAPK1 相比有 80% 同源性， 而 DRAK1、DRAK2 的激酶區(qū)同 DAPK1 相比只有 50% 同源性。

DAPK1?含有幾個(gè)不同的功能域 ， 依次為：激酶區(qū)， 鈣調(diào)素調(diào)節(jié)區(qū)，8?個(gè)連續(xù)的錨蛋白重復(fù)序列，包含 2?個(gè)潛在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的 ROC-COR（Ras?of?complex?proteins， C-terminal?of?ROC）區(qū)，死亡結(jié)構(gòu)域與富含絲氨酸的尾巴。DAPK1?核心激酶區(qū)高度保守，保守的賴氨酸殘基同 ATP 的結(jié)合極為重要;鈣調(diào)素調(diào)節(jié)區(qū) 308?位點(diǎn)的絲氨酸的磷酸化可抑制了鈣調(diào)素白結(jié)合，從而抑制 DAPK1?活性;8?個(gè)錨蛋白重復(fù)序列保證 DAPK1?定位在肌動(dòng)蛋白微絲上;ROC- COR?結(jié)構(gòu)域促進(jìn) GTP?水解，調(diào)節(jié) DAPK1?催化活性，且ROC-COR?片段也可能促進(jìn)與其他 ROCO?家族蛋白的結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞功能;死亡結(jié)構(gòu)域可以參與腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和死亡受體 Fas?等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還可以起到調(diào)節(jié) DAPK?穩(wěn)定性的作用;刪除富含絲氨酸的尾巴可增強(qiáng) DAPK1?誘導(dǎo)的細(xì)胞膜泡形成，但對(duì)體外肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化無(wú)影響 [6]。

因此 DAPK1 的激酶區(qū)域、鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)域和 ROC- COR 區(qū)參與DAPK1 的功能活化。它們決定DAPK1 的作用底物 ， 是主要的調(diào)節(jié)區(qū)域和蛋白激酶抑制劑靶點(diǎn)。DAPK1 的 8 個(gè)連續(xù)的錨蛋白重復(fù)序列、死亡結(jié)構(gòu)域與富含絲氨酸尾巴的區(qū)域無(wú)催化活性 ， 但是對(duì)于 DAPK1 正確的亞細(xì)胞定位及參與蛋白質(zhì)的相互作用具有重要作用。

細(xì)胞內(nèi)部的膜的將細(xì)胞分隔成為一個(gè)個(gè)獨(dú)立的區(qū)室化空間 ， 保證了細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)高效穩(wěn)定的運(yùn)行。有研究表明，蛋白質(zhì)異常的亞細(xì)胞定位可能與多種人類疾病相關(guān)，比如：阿爾茨海默病，腎結(jié)石和腫瘤 [7]。因此研究DAPK 蛋白的亞細(xì)胞定位及其如何參與各種細(xì)胞器功能并發(fā)揮作用，對(duì)于揭示其功能機(jī)制及腫瘤疾病治療具有非常重要的作用。

1.1?DAPK 與細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞由微管、微絲、中間絲組成的蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) [8]。細(xì)胞骨架能夠維持細(xì)胞基本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞多種生理進(jìn)程，如遷移和凋亡等。細(xì)胞骨架的重組裝使凋亡細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，微絲、中間絲及微管結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚重構(gòu)，包裹細(xì)胞器形成凋亡小體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 [9]。

Kuo JC 等報(bào)道 [10]DAPK1 同肌球蛋白輕鏈激酶 （MLC） 的接觸中心有 44% 同源性，體內(nèi)肌球蛋白輕鏈?zhǔn)?DAPK1 磷酸化底物 ， 而 MLC 的磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)膜泡，因此DAPK1 可能與細(xì)胞膜膜泡發(fā)生有關(guān)。

Bialik S?等 [11] 設(shè)計(jì)融合有綠色熒光蛋白的 DAPK1?轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中觀察 DAPK?的細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響， 發(fā)現(xiàn) DAPK1?部分定位于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，尤其是應(yīng)力纖維，其表達(dá)與體內(nèi)肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈上 Ser-19?的磷酸化有關(guān)。缺乏 ROC-COR?結(jié)構(gòu)域的突變體表現(xiàn)為彌漫在細(xì)胞質(zhì)中，并誘導(dǎo)周圍膜濾泡，而不是廣泛的膜突起。相反， 錨蛋白重復(fù)序列的缺失會(huì)導(dǎo)致激酶定位發(fā)生改變。

Houle F 等報(bào)道[12]H2o2 誘導(dǎo)ERK 下游DAPK1 的激活， 而 DAPK1 在體內(nèi)外能夠促進(jìn)肌球蛋白 -1 在 283 位絲氨酸的磷酸化，這種磷酸化對(duì)于 H2o2 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成是至關(guān)重要的，因此 DAPK1 可以作為肌球蛋白 -1 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞骨架重塑的上游蛋白。

1.2?DAPK 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （ endoplasmic reticulum，ER） 是真核細(xì)胞中一個(gè)大的膜包圍的細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)蛋白的合成、折疊、修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí) ER 也是主要的胞內(nèi) Ca2+ 儲(chǔ)存庫(kù)。在某些生理和病理?xiàng)l件下引起未折疊蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)或過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和 Ca2+ 嚴(yán)重失調(diào)，引起細(xì)胞凋亡自噬 [13]。

Gozuacik D 等報(bào)道 [14] DAPK1 可作為 ER 應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡自噬途徑的重要調(diào)節(jié)蛋白，DAPK1 的催化活性通過(guò)ER 應(yīng)激信號(hào)而增強(qiáng)，DAPK1 的缺失導(dǎo)致凋亡和自溶作用均減弱，使細(xì)胞免于 ER 應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

Mebratu YA 等研究報(bào)道 [15]Bcl-2 相互作用殺傷蛋白（Bik）能夠促進(jìn)DAPK?蛋白同細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、 Bcl-2?同源殺傷蛋白（Bak）結(jié)合形成復(fù)合體，同時(shí) Bik?蛋白能夠提高Bak?蛋白的表達(dá)，使其大量的定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的 Bak?蛋白能夠使 DAPK?錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的結(jié)合，加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子的釋放和線粒體鈣離子的積累，從而激活下游 caspase?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

Zhou Y 等報(bào)道 [16] 在喹烯酮誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬過(guò)程中， 活化轉(zhuǎn)錄因子 6（ATF6）和 DAPK1 的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平隨著喹烯酮處理的時(shí)間和劑量的增加而提高，同時(shí)喹烯酮能夠誘導(dǎo)由 DAPK1 介導(dǎo)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（MRLC）的磷酸化，從而激活哺乳動(dòng)物 Atg9（mAtg9） 的自噬小泡轉(zhuǎn)運(yùn)。而用喹烯酮處理敲除 ATF6 和 DAPK1 的細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)自噬作用降低。因此喹烯酮能夠通過(guò) ATF6 上調(diào)DAPK1 的表達(dá)， 從而激活肌球蛋白Ⅱ磷酸化介導(dǎo)的 mAtg9 蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)， 從而造成 ER 應(yīng)激，引起細(xì)胞自噬。

1.3?DAPK 與線粒體

線粒體普遍存在于除哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞以外的所有真核細(xì)胞中 [17]，是細(xì)胞進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換和生物氧化的主要場(chǎng)所，線粒體在腫瘤細(xì)胞的代謝、凋亡、活性氧生成、鈣穩(wěn)態(tài)等多種進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，線粒體功能紊亂影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展 [18]。

Jang CW 等報(bào)道 [19]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β 依賴的凋亡對(duì)體內(nèi)正常組織中受損或異常細(xì)胞的清除起著重要作用，而DAPK1 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β 凋亡途徑的重要組成部分， 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β 能夠通過(guò) Smad 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein） 激活誘導(dǎo) DAPK1 的表達(dá)， 敲弱 DAPK1 可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β 引起的細(xì)胞凋亡， 而單獨(dú)轉(zhuǎn)染 DAPK 的激酶區(qū)時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以阻止線粒體細(xì)胞色素 c 的釋放，進(jìn)而減弱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β 誘導(dǎo)的線粒體損傷，表明 DAPK 是線粒體促凋亡的上游調(diào)節(jié)蛋白。

DAPK2 是 DAPK 家族的五個(gè)成員之一，Schlegel CR 等報(bào)道 [20] 能夠發(fā)揮代謝和調(diào)節(jié)線粒體的作用，DAPK2 的耗竭使線粒體內(nèi)的 SOD2 的量大于胞質(zhì)中 SOD1 時(shí)，線粒體內(nèi)的活性氧水平得到升高，從而誘導(dǎo)超氧化物歧化酶

（SODS）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化 / 激活 ， 造成線粒體的氧化應(yīng)激。同時(shí)沉默 DAPK2 發(fā)現(xiàn)可刺激線粒體自發(fā)去極化。線粒體的氧化應(yīng)激和去極化造成線粒體功能代謝紊亂，功能失調(diào)的線粒體不再為細(xì)胞提供動(dòng)力 ， 進(jìn)而導(dǎo)致線粒體的降解與凋亡的發(fā)生。

DLK/ZIPK 同樣是 DAPK 家族的五個(gè)成員之一，Kogel D 等報(bào)道 [21] 過(guò)表 DLK/ZIPK 能夠誘導(dǎo)野生型細(xì)胞周期抑制因子（p19ARF）和 p53 的大鼠成纖維細(xì)胞凋亡，主要特征為凋亡膜泡生成、線粒體去極化、細(xì)胞色素 c 釋放和caspase-3 的激活。p19ARF 缺乏和 p53 缺乏的小鼠成纖維細(xì)胞中也有 DLK/ZIPK 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。p53 的缺失并不能阻止 DLK/ZIPK 誘導(dǎo)的線粒體膜去極化和細(xì)胞色素 C 的釋放，而且 DLK/ZIPK 的過(guò)表達(dá)也不會(huì)促進(jìn) p53 表達(dá)，因此DLK/ZIPK 能夠獨(dú)立于 p19ARF/p53 信號(hào)通路而觸發(fā)線粒體凋亡通路。

1.4?DAPK 與溶酶體

溶酶體是存在于真核細(xì)胞中的單細(xì)胞膜細(xì)胞器，它體內(nèi)包含有多種水解酶，可分別將脂肪、蛋白質(zhì)、核酸降解為小分子物質(zhì)。細(xì)胞自噬是依賴于溶酶體途徑降解無(wú)用、錯(cuò)誤折疊及多余的蛋白或細(xì)胞器，為細(xì)胞提供能量和合成原料 [22]。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體 1（mTORC1）在被體內(nèi)的生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)及能量等信號(hào)激活后，能加速細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ) [23] 。

DAPK1 是 mTORC 的上游正調(diào)控蛋白，有研究表明 [24] 結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白 2（TSC2）可以同 DAPK1 的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合并被磷酸化，從而通過(guò)溶酶體途徑負(fù)調(diào)控 DAPK1。另有研究 [25] 指出在多種細(xì)胞壓力下，細(xì)胞體內(nèi)能夠自行調(diào)節(jié)TSC2 蛋白的亞細(xì)胞定位，使其定位于到溶酶體上從而抑制mTORC1 的活性，因此，DAPK1 可能受 TSC2 的影響定位于溶酶體上并參與溶酶體降解途徑

目前針對(duì)腫瘤患者病理學(xué)的研究及腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) DAPK?在腫瘤細(xì)胞功能上扮演著重要角色。Inbal?等 [26] 最早發(fā)現(xiàn) DAPK?與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，他們將 DAPK?基因轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中，待腫瘤細(xì)胞 DAPK?表達(dá)基因恢復(fù)正常水平時(shí)，將其注射到同基因型小鼠中發(fā)現(xiàn)能夠延緩高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Kuo?等 [27]?發(fā)現(xiàn) DAPK?能夠干擾踝蛋白和整合素的結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展與轉(zhuǎn)移， 同時(shí) DAPK?在 CL1-5?細(xì)胞中的高表達(dá)抑制腫瘤的侵襲，而在 CL1-0?細(xì)胞中的低表達(dá)則促進(jìn)腫瘤的侵襲。但 DAPK?表達(dá)的改變并不能顯著影響兩種細(xì)胞的增殖和存活。張海濤等 [28] 將 DAPK?基因轉(zhuǎn)染到高轉(zhuǎn)移性 PGCl3?后發(fā)現(xiàn) DAPK 基因能夠抑制該細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附能力。同時(shí)臨床資料也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) DAPK?與腫瘤的發(fā)生和侵襲相關(guān)，Simpson 等 [29] 報(bào)道在 17 例侵襲性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有 15 例腫瘤細(xì)胞中DAPK 表達(dá)缺失，與之形成對(duì)比的是 15 例非侵襲細(xì)胞中只有 1 例出現(xiàn) DAPK 表達(dá)缺失。因此，DAPK 的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究腫瘤細(xì)胞功能提供了一個(gè)新的視角，但是基于腫瘤的復(fù)雜性，未來(lái)仍需進(jìn)行大量的研究。

目前針對(duì) DAPK 蛋白的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)分子信號(hào)通路與組織、細(xì)胞差異表達(dá)的檢測(cè)，關(guān)于

DAPK 蛋白的亞細(xì)胞定位及參與各種細(xì)胞器的功能的報(bào)道相對(duì)有限，開展 DAPK 蛋白的定位及其對(duì)細(xì)胞器功能影響的研究，將有助于拓展 DAPK 蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等機(jī)制。同時(shí)目前針對(duì) DAPK 蛋白的抗腫瘤藥物的研發(fā)更多的是針對(duì)該蛋白的活性和啟動(dòng)子甲基化，未來(lái)如能結(jié)合 DAPK 的亞細(xì)胞定位及其對(duì)細(xì)胞器功能影響的相關(guān)研究，可能有機(jī)會(huì)成為今后腫瘤靶向治療以及治療后效果評(píng)估的可行途徑。

international journal on programmed cell death 2014， 19（2）：329- 338.

• Grootjans J， Kaser A， Kaufman RJ， Blumberg RS： The unfolded protein response in immunity and inflammation. Nature reviews Immunology 2016， 16（8）：469-484.
• Gozuacik D， Bialik S， Raveh T， Mitou G， Shohat G， Sabanay H， Mizushima N， Yoshimori T， Kimchi A： DAP-kinase is a mediator of endoplasmic reticulum stress-induced caspase activation?and?autophagic?cell?death.?Cell?death?and?differentiation 2008， 15（12）：1875-1886.

18.?Kim HJ， Maiti P， Barrientos A：?Mitochondrial

ribosomes in cancer. Seminars in cancer biology 2017， 47：67-81.

• Ciechanover A： Intracellular protein degradation： From a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Best practice & research Clinical haematology 2017， 30（4）：341-355.
• Lin Y， Henderson P， Pettersson S， Satsangi J， Hupp T， Stevens C： Tuberous sclerosis-2 （TSC2） regulates the stability of death-associated protein kinase-1 （DAPK） through a lysosome- dependent degradation pathway. The FEBS journal 2011， 278（2）：354-370.

通訊作者：林堯，yaolin@fjnu.edu.cn

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（2018J01723）