葛慈斌 藍江林 劉波 王凱 鄭雪芳

摘 要：【目的】解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754是一株高產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶的芽胞桿菌，具有在復合飼料酶制劑生產(chǎn)中的應用潛力。為深入了解該菌株的發(fā)酵進程，以便實現(xiàn)對發(fā)酵過程進行最優(yōu)化控制?！痉椒ā坎捎?0 L發(fā)酵罐發(fā)酵菌株FJAT-8754，分析發(fā)酵過程中菌體數(shù)量、pH值、底物濃度、纖維素酶和淀粉酶等的動態(tài)變化，并選用Logistic方程和Luedeking-Piret方程構建發(fā)酵動力學模型?！窘Y果】根據(jù)菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中各參數(shù)變化動態(tài)建立了模擬菌體生長、纖維素酶與淀粉酶產(chǎn)生和底物消耗的動力學模型，并應用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行計算與分析，Origin 9.0軟件經(jīng)非線性擬合與優(yōu)化，獲得了最佳模型參數(shù)值?！窘Y論】所構建的動力學模型的計算值與實驗值擬合良好，較好地反映了菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和酶合成的動力學特征。菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中產(chǎn)物的合成屬于生長部分偶聯(lián)型。

關鍵詞：解淀粉芽胞桿菌;發(fā)酵;動力學模型;纖維素酶;淀粉酶

中圖分類號：Q 938文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）06-697-08

Abstract： 【Objective】To construct a kinetic model for the optimized fermentation of Bacillus amyloliquefaciens FJAT-8754， which was capable of effectively producing cellulase and amylase. 【Method】A 50 L fermenter experiment was conducted to study the cellular growth，pH value，enzyme production and carbohydrate consumption of the fermentation and for subsequent process optimization. A kinetic model was established using the logistic and Luedeking-Piret equations， and experimental data calculated and analyzed with SPSS 16.0 software. 【Result】 The optimal fermentation conditions fitted well in the non-linear model as shown by Origin 9.0 software. 【Conclusion】The kinetic model obtained accurately reflected the performance of the fermentation. The cellulase and amylase were products of FJAT-8754 metabolism in the culture.

Key words：Bacillus amyloliquefaciens; fermentation; kinetic model; cellulase; amylase

0 引言

【研究意義】解淀粉芽胞桿菌 Bacillus myloliquefaciens是芽胞桿菌科Bacillaceae芽胞桿菌屬Bacillus的一種革蘭氏陽性桿菌，由于其能產(chǎn)生液化淀粉酶分解淀粉，而被定為該名[1]。解淀粉芽胞桿菌在自然界廣泛存在，許多菌株可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細菌生長的代謝產(chǎn)物及多種水解酶，因此具有防治植物病害、促進動植物生長、水果保鮮等功能[2-4]。有較多學者對從自然界分離到的解淀粉芽胞桿菌進行了發(fā)酵方面的研究，期望將其應用于植病生防、動物飼養(yǎng)、環(huán)境保護等領域。王卉等[5]用正交試驗法優(yōu)化了具有植物促生長效果的解淀粉芽胞桿菌L-S60的固體發(fā)酵工藝，可以使發(fā)酵產(chǎn)物中的菌體數(shù)達到2.42×1010 cfu·g-1;酈金龍等通過響應面分析法，確定了解淀粉芽胞桿菌菌株11568液體發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最優(yōu)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件 [6];王全等[7]對解淀粉芽胞桿菌菌株12-7產(chǎn)抗菌蛋白的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，為將該菌株應用于棉花黃萎病生物農(nóng)藥的研制開發(fā)奠定了基礎。

【前人研究進展】發(fā)酵動力學研究微生物發(fā)酵過程中菌株生長速率、培養(yǎng)基消耗速率和產(chǎn)品形成速率間的相互作用和隨時間變化的規(guī)律，是對微生物生長和產(chǎn)物合成過程的定量描述。目前，關于解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶發(fā)酵動力學的研究未見報道，但其他芽胞桿菌發(fā)酵動力學研究有過許多的報道。歐志敏等闡明了蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus菌株CGMCC No.12336分批發(fā)酵過程的動力學模型，并擬合得到了動力學參數(shù) [8];于曉萌等[9]優(yōu)化了巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium菌株GJT321生產(chǎn)Levan果聚糖的發(fā)酵條件，并研究了該菌株發(fā)酵生產(chǎn)Levan果聚糖的數(shù)字化模型;田雪等[10]基于Logistic方程和Luedeking-Piret等方程建立了地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis產(chǎn)β-甘露聚糖酶分批發(fā)酵動力學模型;孫宏等[11]優(yōu)化了枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis菌株Z-4產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件，探索了該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶過程中細胞生長和纖維素酶產(chǎn)物積累的規(guī)律，建立了相關數(shù)學模型;馬永強等[12]建立了地衣芽胞桿菌菌株2709產(chǎn)堿性蛋白酶的發(fā)酵動力學模型;劉朝輝等[13]構建了能夠較好表征枯草芽胞桿菌TJ-200603分批發(fā)酵過程中菌體細胞生長、產(chǎn)物β-甘露聚糖酶合成以及基質總糖消耗的3個動力學方程，這些都為各菌株發(fā)酵過程的在線控制和預測提供了理論基礎。

【本研究切入點】解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754是本研究所篩選到的具有高產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶復合酶的菌株，為了通過發(fā)酵獲得大量的菌體及高活力的復合酶制劑產(chǎn)品，王凱等前期對菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化[14]。【擬解決的關鍵問題】為了從數(shù)學層面去分析、揭示菌株發(fā)酵過程中菌體數(shù)量、底物消耗、酶產(chǎn)生的動態(tài)變化，為該菌株的中試擴大培養(yǎng)以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎，作者進行了菌株的發(fā)酵動力學研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株：解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754，保存于福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫;培養(yǎng)基：菌株FJAT-8754的一級種子液培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，二級種子液培養(yǎng)基的組成為玉米淀粉10 g、豆粕粉10 g、NaCl 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4·2H2O 0.5 g、K2HPO4·2H2O 0.5 g、CaCl2 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2，上罐發(fā)酵培養(yǎng)基同二級種子液培養(yǎng)基。

1.2 菌株FJAT-8754的發(fā)酵培養(yǎng)

活化菌株FJAT-8754，并分別制備一級、二級種子液。應用50 L發(fā)酵罐（GUJS-50L型，鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術公司），參照葛慈斌等[15]的方法，配制發(fā)酵培養(yǎng)基30 L、滅菌、接種，設定罐溫35℃、通氣量30 L·min-1、轉速200 r·min-1，進行發(fā)酵培養(yǎng)，并每隔4 h 記錄發(fā)酵罐中發(fā)酵液的pH值、DO值，并取樣300 mL分裝成3份，用于發(fā)酵液中活菌數(shù)、纖維素酶與淀粉酶活力、總糖、還原糖等狀態(tài)參數(shù)的測定。共進行3次發(fā)酵試驗，取上述狀態(tài)參數(shù)平均值進行發(fā)酵動力學分析。

1.3 發(fā)酵液的活菌數(shù)測定

采用稀釋涂布平板法測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，取×10-4、×10-5、×10-6等3個梯度的稀釋液100 μL，均勻涂布在LB培養(yǎng)基平板（每個濃度重復3次），放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，計算各發(fā)酵液的菌體數(shù)。

1.4 纖維素酶、淀粉酶活力的測定

取不同時段的發(fā)酵液5 mL，6 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，置于4℃冰箱備用;參照王凱等[14]的方法，用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法測定發(fā)酵液中纖維素酶、淀粉酶的活力。

1.5 發(fā)酵液總糖、還原糖含量的測定

還原糖含量測定：采樣3，5-二硝基水楊酸法[16]測定，取1 mL發(fā)酵液于50 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，取定容后的l mL稀釋液于20 mL的比色管中，加入1.5 mL DNS溶液，混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容至20 mL，于520 nm波長處測吸光度，計算出發(fā)酵液中的還原糖含量。總糖含量測定：取5 mL發(fā)酵液于100 mL錐形瓶中，加蒸餾水15 mL和6 mol·L-1鹽酸15 mL，混勻，在沸水浴中加熱30 min后，用碘化鉀-碘溶液檢測水解程度，至完全水解;冷卻后，加入甲基紅指示液兩滴，用10% NaOH溶液中和至紅色消失，過濾并定容至100 mL;取定容后的溶液1 mL，按照還原糖的測定方法測定發(fā)酵液中的總糖含量。

1.6 動力學模型的構建

1.6.1 菌株FJAT-8754的生長動力學模型

在描述發(fā)酵過程中菌體細胞生長時，最常用的是Logistic方程（阻滯方程），該方程能較好描述菌體的生長規(guī)律。Logistic方程為：

式中：μm為最大比生長速率，h-1;X為菌體濃度，×107 cfu ·mL-1;X0為初始菌體濃度，×107 cfu ·mL-1;Xm為最大菌體濃度，×107 cfu ·mL-1;t為時間，h。對方程（1）積分可得菌體濃度X的時間函數(shù)為：

以方程（2）為自定義函數(shù)，利用Origin 9.0軟件對菌株FJAT-8754的生長進行非線性擬合，即可得到該菌株生長的動力學模型。

1.6.2 菌株FJAT-8754的纖維素酶、淀粉酶合成動力學模型

微生物發(fā)酵過程中除產(chǎn)生菌體以外，還會形成次級代謝產(chǎn)物。Elmer等[17]把代謝產(chǎn)物的形成方式分為三類，即生長相關型（也叫生長偶聯(lián)型）、部分生長相關型（部分偶聯(lián)型）和非生長相關型（非偶聯(lián)型）。Luedeking-Piert方程常用于描述發(fā)酵產(chǎn)物合成動力學，當發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生同時存在非生長相關型和生長相關型時，用下列公式表示：

式中：P為纖維素酶或淀粉酶的酶活，U ·mL-1;α為與生長相關聯(lián)的產(chǎn)物合成系數(shù);β為與生長無關的產(chǎn)物合成比速率。

將公式（2）帶入公式（3）并積分，整理得到公式（4）：

將已知X0、Xmax、μmax擬合值代入公式（4），應用Origin 9.0軟件進行非線性自定義函數(shù)擬合，使用Levenberg-Marguardt參數(shù)擬合工具箱，分別進行擬合求參數(shù)α、β，將參數(shù)帶入公式（4），即得解淀粉芽胞桿菌FJAT-纖維素酶、淀粉酶合成動力學模型：

（1）纖維素酶合成動力學模型

（2）淀粉酶合成動力學模型

1.6.3 菌株FJAT-8754的碳源消耗動力學模型

在菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中，玉米淀粉作為唯一碳源，主要用于產(chǎn)生新的菌體、維持菌體基本生命活動和代謝產(chǎn)物的生成這3個方面;但在發(fā)酵過程中，維持菌體基本生命活動所需消耗的底物所占比例相對較小，經(jīng)常被忽略不計，為方便建模，可將該菌株發(fā)酵過程中玉米淀粉的消耗分為菌體生長消耗和產(chǎn)物合成消耗2部分，因此底物消耗方程式可用類似于Luedeking-Piert模型，具體公式如下：

式中：S為碳源（玉米淀粉）的質量濃度，mg ·mL-1;YX/S為細胞對碳源的得率常數(shù);YP/S為酶活對碳源的得率常數(shù)。

將公式（2）、（3）代入公式（7），并進行積分處理得：

將纖維素酶、淀粉酶合成動力學公式（5）、（6）代入（8）整理得：

其中：α1為纖維素酶合成系數(shù)，β1為產(chǎn)物合成比速率（對纖維素酶），Y1為纖維素酶活產(chǎn)物與基質的得率常數(shù);α2為淀粉酶合成系數(shù)，β2為產(chǎn)物合成比速率（對淀粉酶）;Y2為淀粉酶酶活產(chǎn)物與基質的得率常數(shù);S0為培養(yǎng)初期的初始基質濃度，μg ·mL-1。

利用Origin 9.0軟件，采用Levenberg-Marguardt參數(shù)擬合工具箱，對菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中基質消耗進行擬合，可得底物（總糖）消耗的動力學模型。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌FJAT-8754的發(fā)酵特征

解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，隨著菌株的生長，發(fā)酵液中的DO值、pH值、菌體濃度、還原糖濃度等參數(shù)也相應發(fā)生著一系列的動態(tài)變化（圖1）。從圖1可以看出，菌株FJAT-8754接種4 h后進入對數(shù)生長期，并在24 h時進入穩(wěn)定期，28 h時菌體濃度達到最大值1.30×109 cfu ·mL-1，此后菌體濃度緩慢下降;纖維素酶、淀粉酶的酶活在剛開始發(fā)酵時極低，隨著菌株進入對數(shù)生長期，酶活也隨之迅速升高，并在32 h時（略遲于菌體濃度達到最大值的時間）達到最大酶活，酶活分別為125.8、1 267.7? U ·mL-1。

菌株FJAT-8754發(fā)酵液的溶氧量（DO）在開始培養(yǎng)后便快速下降，在16 h時達到最低、只有18.2，此后隨著底物的消耗和菌株生長進入穩(wěn)定期、衰亡期，發(fā)酵液的DO值逐漸上升。發(fā)酵液的pH在發(fā)酵2 h后開始快速下降，至發(fā)酵12 h時達到最低點5.22，這可能是因為菌體快速生長大量消耗葡萄糖產(chǎn)酸的緣故;之后pH值開始緩慢上升，至發(fā)酵36 h時升至6.17。

發(fā)酵液的總糖含量在0～4 h幾乎沒變化，之后隨著菌株進入對數(shù)生長期，菌體快速生長需要消耗大量的碳源而開始迅速降低，至發(fā)酵20 h后由于菌體增長速度放緩，總糖消耗變小，濃度緩慢降低至基本保持穩(wěn)定。還原糖濃度在0～4 h變化不大，發(fā)酵4 h后隨著大量總糖被水解，還原糖濃度開始較快上升，并于16 h時達到峰值2.53 mg ·mL-1，之后由于總糖水解的減少，發(fā)酵液中的還原糖濃度又開始下降，至發(fā)酵36 h時降至1.92 mg ·mL-1。

分析菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的菌體濃度、DO值、pH值、纖維素酶活力、淀粉酶活力、總糖濃度和還原糖濃度等7個參數(shù)之間的相關性（表1），可以看出，pH值與其他6個參數(shù)之間的相關性均不顯著;菌體濃度與除pH值之外的另5個參數(shù)之間存在著極顯著的相關性，其中與DO、總糖濃度之間是負相關;纖維素酶活力與總糖濃度、淀粉酶活力及還原糖濃度之間的相關性也極顯著，與DO之間的相關性顯著;淀粉酶活力與總糖濃度、還原糖濃度、DO之間的相關性與纖維素酶活性基本一致;總糖濃度與DO之間顯著相關，與還原糖濃度之間則極顯著負相關;還原糖濃度與DO之間也存在著極顯著的負相關關系。

2.2 解淀粉芽胞桿菌FJAT-8754生長動力學

解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754在50 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中，菌體細胞在經(jīng)過短暫的延遲期后，進入對數(shù)生長期，之后趨于穩(wěn)定（圖1）。用Logistic方程描述菌株生長過程，用origin軟件對試驗所得的數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得到了該菌株生長的動力學模型（10），擬合模型曲線（圖2）R2=0.99766，且試驗值都在95%的置信區(qū)間內(nèi)，模型預測值與實測值能較好的擬合。

2.3 解淀粉芽胞桿菌FJAT-8754的纖維素酶、淀粉酶合成動力學

由菌株FJAT-8754發(fā)酵過程參數(shù)測定（圖1）可以看出，纖維素酶、淀粉酶的活性隨菌體的增長而增加，達到穩(wěn)定期后這兩種酶才達到最高酶活，表明這兩種酶的形成方式為部分偶聯(lián)型。運用Luedeking-Piert公式計算得到的菌株FJAT-8754產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶合成動力學模型分別為公式（5）和（6）;產(chǎn)纖維素酶的擬合模型曲線見圖3，R2=0.99657;產(chǎn)淀粉酶的擬合模型曲線見圖4，R2=0.99298。

2.4 菌株FJAT-8754的底物（總糖）消耗動力學模型

用類似于Luedeking-Piert模型計算得到的菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中底物（總糖）消耗的動力學模型見公式（11），擬合模型曲線見圖5，R2=0.98905。

3 討論與結論

菌株FJAT-8754發(fā)酵過程中，菌體生長、纖維素酶與淀粉酶合成、底物消耗互為聯(lián)系，密不可分。菌株FJAT-8754纖維素酶、淀粉酶活力的增長趨勢滯后于菌體細胞生長，即產(chǎn)酶峰值滯后于菌體濃度峰值，這與鄭毅等[18]、徐瑩等[19]的研究結果較相似，即菌體細胞生長進入穩(wěn)定期后，發(fā)酵體系中纖維素酶、淀粉酶的生產(chǎn)量仍在增長，酶活力繼續(xù)提高，由此認為菌株FJAT-8754發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶分為菌體生長和產(chǎn)物合成兩個階段，產(chǎn)物合成屬于部分偶聯(lián)型。

發(fā)酵動力學是微生物發(fā)酵過程優(yōu)化和控制的重要基礎，研究發(fā)酵動力學有助于深入了解微生物的代謝規(guī)律，從而有利于建立合理的發(fā)酵工藝，或是優(yōu)化已有的發(fā)酵過程 [20];Monod、Aiba、Logistic和Luedeking-Piret等函數(shù)常用于發(fā)酵動力學模型的構建[21-22]。李浩等[23]對生防菌吡咯伯克霍爾德氏菌菌株JK-SH007液體分批發(fā)酵產(chǎn)生抑菌活性的動力學進行了研究，運用非線性擬合的方法確立了該菌株分批發(fā)酵動力學模型。Zhang等[24]建立了釀酒酵母菌株D254發(fā)酵過程中酵母菌生長、乙醇產(chǎn)生和底物消耗的動力學模型，有助于及時了解發(fā)酵液中乙醇及殘?zhí)堑臐舛?。趙健烽等[25]以Logistic、Luedeking-Piret等方程為基礎，建立了銅綠假單胞菌菌株M14808發(fā)酵過程中菌體生長、鼠李糖脂合成和碳源消耗的動力學模型，擬合度較好;周有彩等[26]構建了50 L發(fā)酵罐小球藻分批培養(yǎng)的Logic和Ludeking-Piret動力學模型，可用于描述小球藻分批培養(yǎng)細胞生長、蛋白質合成和葡萄糖消耗的過程;潘丹陽等[27]通過Logistic方程構建了層生鐮孢菌細胞生長、幾丁質脫乙酰酶（CDA）合成及糖基質消耗的非結構動力學模型;聶國興等[28]基于Logistic和Luedeking-Piret，根據(jù)分批發(fā)酵過程中菌體生長、總糖消耗、反應體系pH值變化規(guī)律等構建枯草芽胞桿菌E79發(fā)酵過程中菌體細胞生長、產(chǎn)物合成及基質消耗的動力學模型，并應用Oirgin7.5軟件經(jīng)非線性擬合與優(yōu)化，獲得了最佳模型參數(shù)值，能較好反映菌株E79發(fā)酵的動力學特征。

本研究使用Origin 9.0軟件對解淀粉芽胞桿菌菌株FJAT-8754產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶復合酶發(fā)酵過程進行分析處理，建立了該菌株發(fā)酵過程中菌體生長、纖維素酶與淀粉酶合成以及底物消耗的動力學模型。經(jīng)過模型擬合，發(fā)現(xiàn)這些模型與實驗結果擬合較好，R2都在0.989以上，說明這些模型可較準確地描述發(fā)酵過程中菌株FJAT-8754菌體生長、纖維素酶與淀粉酶合成、基質消耗的變化規(guī)律。

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（責任編輯：林海清）