王晶波 秦文 楊倬 王麗媛 卓勤 宮照龍 沈葹

摘 要：目的：開展國內(nèi)外多種單花蜜體外抑菌活性差異的系統(tǒng)評價。方法：以無菌Mueller-Hinton Broth培養(yǎng)基稀釋得到3.75%～90%（w/v）不同濃度的單花蜜，采用96微孔板改良法，用空白無菌培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)菌株作對照孔，測定18種單花蜜對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續(xù)時間、對數(shù)期持續(xù)時間和最大細(xì)菌密度5個抑菌活性指標(biāo)。結(jié)果：18種單花蜜均具有不同程度的抑菌活性，且抑菌生長曲線均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株對照孔，延長了3種致病菌的遲緩期持續(xù)時間、縮短了對數(shù)期持續(xù)時間和降低了最大細(xì)菌密度，其中小茴香蜂蜜最低抑菌濃度為7.5%，最低殺菌濃度為15%，均優(yōu)于麥盧卡蜂蜜。結(jié)論：96微孔板改良法靈敏、快速、客觀、可直觀顯示不同的單花蜜具有抑菌活性差異，其中小茴香蜂蜜、葵花蜂蜜、椴樹蜂蜜活性最為顯著，本文為蜂蜜的功能評價與市場開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：微孔板改良法;體外抑菌;小茴香蜂蜜;單花蜜

我國是世界養(yǎng)蜂大國，2016年我國蜂蜜產(chǎn)量高達(dá)48.14 萬t，出口數(shù)量占世界蜂蜜出口量的12.32%[1]，且我國地域遼闊，蜜源植物群落和種類名目繁多，分布極為廣泛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，蜂蜜對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有不同程度的抑制作用[2-5]，可加速創(chuàng)傷組織修復(fù)及對胃潰瘍和胃炎具有治療作用，國內(nèi)外研究多發(fā)現(xiàn)尤以新西蘭的麥盧卡蜂蜜抗菌功效突出，被認(rèn)為是一種特殊藥物，成為蜂蜜抑菌活性評價的標(biāo)志性產(chǎn)品[6-7]。我國蜂蜜應(yīng)用歷史悠久且蜂蜜種類繁多，數(shù)千年前蜂蜜就有被用來外敷傷口防治感染和消化道治療的記載[8-11]，但目前缺乏對于我國不同蜜源植物的單花蜜系統(tǒng)抑菌活性評價。因此，系統(tǒng)評價我國不同蜜源植物蜂蜜的抑菌特性，且與國外蜂蜜做對比研究，提升我國蜂蜜的功效價值與市場開發(fā)勢在必行。

目前，蜂蜜的體外抑菌評價方法多采用瓊脂擴(kuò)散法[12-14]或營養(yǎng)肉湯梯度稀釋法[15]，瓊脂擴(kuò)散法通常通過測定抑菌圈直徑的大小來定性抑菌活性，該法經(jīng)典、簡單、易掌握，但精確度不高;營養(yǎng)肉湯梯度稀釋法常用來定量最小抑菌濃度，結(jié)果比瓊脂擴(kuò)散法精確，但操作較為復(fù)雜，試劑耗費多，人為誤差大，不適用于樣品的高通量檢測。近年來，有報道96微孔板法[3，16]，其操作過程比較簡單，試劑耗費少，結(jié)果精確直觀，重復(fù)性好，但報道的文獻(xiàn)方法缺乏對抑菌遲緩期持續(xù)時間和對數(shù)期持續(xù)時間的評價，因此，本文將96微孔板法與抑菌生長曲線[17]方法結(jié)合建立了96微孔板改良法，可靈敏、快速、客觀地評價單花蜜的抑菌活性。采用96微孔板改良法，通過最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續(xù)時間、對數(shù)期持續(xù)時間和最大細(xì)菌密度等5 個抑菌指標(biāo)，對12種國產(chǎn)單花蜜（洋槐、棗花、荊條、椴樹、葵花、小茴香、蕎麥、五味子、枸杞、黃連、土黃連、荔枝）和6種國外單花蜜（麥盧卡、薰衣草、紅桉樹、向日葵、橙花）的抑菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)評價。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Mueller-Hinton Broth培養(yǎng)基（MHB），北京索萊寶科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、腦心浸出液肉湯（BHI）、細(xì)菌瓊脂粉和血瓊脂平板，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

酶標(biāo)儀SpectraMax i3x，基因有限公司;生化培養(yǎng)箱MMM Incucell 222，德國MMM公司;電熱恒溫水槽DK-450B，上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 樣本采集及處理

單花蜜樣本，均購買自森蜂園、汪氏蜜蜂園、同仁堂、農(nóng)科院等知名品牌，包括A洋槐蜂蜜（產(chǎn)地山東沂蒙）、B棗花蜂蜜（產(chǎn)地江西南昌）、C荊條蜂蜜（產(chǎn)地北京昌平）、D椴樹蜂蜜（產(chǎn)地長白山）、 E葵花蜂蜜（產(chǎn)地內(nèi)蒙古臨河）、F小茴香蜂蜜（產(chǎn)地玉門）、G蕎麥蜂蜜（產(chǎn)地北京）、H五味子蜂蜜（產(chǎn)地北京）、I枸杞蜂蜜（產(chǎn)地浙江衢州）、J黃連蜂蜜（產(chǎn)地上海奉賢）、K土黃連蜜（產(chǎn)地江西南昌）、L荔枝蜂蜜（產(chǎn)地北京）、M薰衣草蜂蜜（產(chǎn)地西班牙）、N紅桉樹蜂蜜（TA 20+）（產(chǎn)地澳大利亞）、O向日葵蜂蜜（產(chǎn)地德國）、P橙花蜂蜜（產(chǎn)地法國）、Q麥盧卡蜂蜜（UMF 5+）（產(chǎn)地新西蘭）、R麥盧卡蜂蜜（UMF 15+）（產(chǎn)地新西蘭），均室溫避光保存。單花蜜樣品各取9g，加入10 mL無菌MHB培養(yǎng)基，以37℃水浴輔助溶解、混勻，然后用無菌MHB培養(yǎng)基逐級稀釋得到3.75%、7.5%、15%、30%、45%、60%、75%、90%（w/v）不同濃度的蜂蜜溶液，4℃冰箱保存，1周內(nèi)使用。

1.3 菌種信息

金黃色葡萄球菌CICC 21600、沙門氏菌CICC 21513、大腸埃希氏菌CICC 21530，均為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。用BHI復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株，于營養(yǎng)瓊脂平板上37℃、24h進(jìn)行復(fù)蘇傳代備用。實驗時取24h細(xì)菌，用無菌MHB培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度為0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋?×108CFU/mL），并用MHB培養(yǎng)基稀釋500倍作為實驗用細(xì)菌原液（2×105CFU/mL）。

1.4 最低抑菌濃度的測定

本實驗采用96微孔板法[16]測定最低抑菌濃度（MIC），樣品組每孔依次加入細(xì)菌原液10μL和不同濃度的蜂蜜溶液190μL，重復(fù)測定3 次，以無菌MHB培養(yǎng)基作為空白組，以細(xì)菌原液10μL加入無菌MHB培養(yǎng)基菌株190μL作為對照組。用酶標(biāo)儀于600 nm測定培養(yǎng)前和37℃培養(yǎng)24h后的吸光度值，分別記為OD0和OD24，空白組調(diào)零，蜂蜜對細(xì)菌的抑制率按式（1）計算，抑制率為100%對應(yīng)的最小蜂蜜濃度為該單花蜜的最低抑菌濃度（MIC）。

抑制率（%）=（1-樣品組OD24-樣品組OD0對照組OD24-對照組OD0）×100%（1）

1.5 最低殺菌濃度的測定

分別吸取1.4實驗中所有抑制率為100%相應(yīng)孔的蜂蜜稀釋液各10μL到血瓊脂平板，均勻涂布后37℃培養(yǎng)24h，以允許小于0.1%的細(xì)菌生長，即血瓊脂平板上菌落數(shù)≤10對應(yīng)的最小蜂蜜濃度，確定為該單花蜜的最低殺菌濃度（MBC）。

1.6 抑菌生長曲線

本實驗以96微孔板法為基礎(chǔ)，結(jié)合48h蜂蜜抑菌生長曲線的測定[17]形成96微孔板改良法，來測定蜂蜜對3種致病菌的抑菌活性，具體方法為：樣品組每孔依次加入細(xì)菌原液10μL和30%（w/v）的蜂蜜溶液190μL，重復(fù)測定3 次，以無菌MHB培養(yǎng)基作為空白組，以細(xì)菌原液10μL加入無菌MHB培養(yǎng)基菌株190μL作為對照組。采用酶標(biāo)儀37℃孵育并于600nm連續(xù)測定吸光度值，每間隔10min振動5s，每30min測定1次吸光度值，持續(xù)測定48h，以持續(xù)時間為橫坐標(biāo)、以吸光度值為縱坐標(biāo)繪得3種致病菌在不同單花蜜的作用下48h內(nèi)的生長曲線，計算出遲緩期持續(xù)時間、對數(shù)期持續(xù)時間和最大細(xì)菌密度等指標(biāo)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC和MBC測定結(jié)果

所有單花蜜樣本對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌均有不同程度的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為7.5%～75%和15%～90%，對沙門氏菌的MIC和MBC均為30%～60%，對大腸埃希氏菌的MIC和MBC分別為15%～60%和30%～75%;此外，不同蜜源的單花蜜抑菌差異顯著，其中E（葵花蜂蜜）、F（小茴香蜂蜜）對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別低達(dá)7.5%、15%，R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為15%、30%，F(xiàn)（小茴香蜂蜜）、R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）對沙門氏菌的MIC和MBC均為30%，對大腸埃希氏菌的MIC和MBC分別為15%、30%。結(jié)果顯示，葵花蜂蜜和小茴香蜂蜜對金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于麥盧卡蜂蜜UMF 15+，小茴香蜂蜜對沙門氏菌和大腸埃希氏菌的抑菌活性和麥盧卡蜂蜜相同（圖1）。

2.2 抑菌生長曲線結(jié)果

根據(jù)不同蜜源單花蜜（30% w/v濃度）對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的抑菌生長曲線（圖2），可以得出遲緩期持續(xù)時間、對數(shù)期持續(xù)時間和最大細(xì)菌密度。由附表可知，與標(biāo)準(zhǔn)菌株對照組對比，18種單花蜜均延長了對3種致病菌的遲緩期持續(xù)時間、縮短了對數(shù)期持續(xù)時間和降低了最大細(xì)菌密度，其中對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的遲緩期持續(xù)時間分別為≥6.7±0.3h、≥7.6±0.3h、≥7.3±0.3h;對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的對數(shù)期持續(xù)時間分別為0～9.3h、0～5.3h和0～5.8h;對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌的最大細(xì)菌密度以最大吸光度值表示，分別為0～0.64、0～0.50和0～0.66。研究發(fā)現(xiàn)，D（椴樹蜜）對金黃色葡萄球菌的生長曲線具有明顯抑制作用，E（葵花蜜）、F（小茴香蜂蜜）、N（紅桉樹蜜）、O（向日葵蜜）和R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）在48h內(nèi)未見3種致病菌生長，對致病菌具有顯著的完全抑制活性，抑菌生長曲線均為吸光度值為零的直線。

3 結(jié)論

本研究采用96微孔板改良法，測定了不同蜜源單花蜜的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、遲緩期持續(xù)時間、對數(shù)期持續(xù)時間和最大細(xì)菌密度5個指標(biāo)，該方法靈敏、快速、客觀，可直觀對比國內(nèi)外18種單花蜜的抑菌活性及差異。所有樣本均具有差異顯著的抑菌活性，且抑菌生長曲線均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株對照孔，延長了3種致病菌的遲緩期持續(xù)時間、縮短了對數(shù)期持續(xù)時間和降低了最大細(xì)菌密度，其中D（椴樹蜜）、E（葵花蜜）、F（小茴香蜂蜜）、N（紅桉樹蜜）、O（向日葵蜜）和R（麥盧卡蜂蜜UMF 15+）活性顯著，尤以葵花蜂蜜和小茴香蜂蜜的抑菌活性優(yōu)于麥盧卡蜂蜜，本文的研究結(jié)果為提升我國蜂蜜的功效價值與小眾蜂蜜的市場開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。蜂蜜化學(xué)成分復(fù)雜，富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)成分，同時還含有多種酚酸類、黃酮類、過氧化氫等活性物質(zhì)[18]，因此，可進(jìn)一步開展蜂蜜的抑菌成分與功效相關(guān)性研究，為蜂蜜在臨床用藥和食物保健等方面提供科學(xué)依據(jù)，為蜂蜜的多元化應(yīng)用開辟更加廣闊的前景。

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Abstract：Objective To evaluate the antibacterial activities of various domestic and foreign various monofloral honeys in-vitro systematically.Method Using 96-well microplates modified method，monofloral honeys were diluted in sterile Mueller-Hinton Broth medium to obtain different concentrations from 3.75% to 90%（w/v），compared with blank sterile medium and standard strain，5 indicators of antibacterial activities of the 18 monofloral honeys against Staphylococcus aureus， salmonella and Escherichia coli were determined，including minimum inhibitory concentration，minimum bactericidal concentration，lag phase duration，logarithmic duration and maximum bacterial density.Result It was indicated that the 18 monofloral honeys had different antibacterial activities，and were better than the standard strain control well based on the inhibition growth curves.The 18 monofloral honeys prolonged the durations of lag phase，shortened durations of logarithmic duration and reduced the maximum bacterial density against three pathogenic bacteria.The minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration of fennel honey was 7.5% and 15%，which were better than Manuka honey.Conclusion 96-well microplates modified method is sensitive，fast，objective and intuitive to indicate that different monofloral honeys have discrepant antibacterial activities，especially fennel honey，sunflower honey and linden honey can remarkably inhibited the growth of three pathogenic bacteria，which provided the scientific basis for functional evaluation and market development of honeys.

Keywords：Microplates Modified Method;antibacterial activity in vitro;fennel honey;monofloral honey

（責(zé)任編輯 李婷婷）