畢玉艷

七鰓鰻作為一種營半寄生方式生存的無頜類脊椎動物，被認為是脊椎動物進化的始祖，其存在至少可以追溯到3.6億年前[1～2]。自從2004年，一種新型的適應性免疫方式在七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)后。從此各個領域的研究者紛紛對七鰓鰻的研究表現(xiàn)出很大的研究興趣，大量的捕撈七鰓鰻用于科學研究，據(jù)報道，隨著對于日本七鰓鰻的不斷研究，日本七鰓鰻的數(shù)量在不斷減少，如果不改變這種現(xiàn)狀，這將會成為七鰓鰻研究領域一項阻礙。本研究通過Illumina高通量測序平臺，對日本七鰓鰻的鰓組織進行轉錄組測序分析，分析七鰓鰻被刺激后精氨酸相關代謝過程的變化。發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻中存在與精氨酸代謝有關的具有高度同源性的酶，并且發(fā)揮著哺乳動物中相關酶相同的作用。精氨酸在日本七鰓鰻被復合抗原刺激后，T淋巴細胞的免疫應答增加，精氨酸的存在是否對這個過程有促進作用，有待進一步研究。

1 材料與方法

從黑龍江省松花江流域同江地區(qū)捕撈日本七鰓鰻，將活體日本七鰓鰻置于實驗室水族箱中暫養(yǎng)。1 周后選取 24 條健康的個體分成對照組和實驗組。其中將實驗組用復合抗原浸泡免疫 1 h 而后進行免疫刺激。用0.9%NaCl溶液配制的復合抗原（滅活的啤酒酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄各 1×109 個/mL），使用時稀釋至3000倍。實驗組需要經(jīng)過隔一周一次的 2 次加強免疫，最后一次免疫后 3 天取其新鮮的鰓組織。而復合抗原只用于實驗組，對照組其他處理方式與實驗組相同。

1.1 方法

1.1.1 RNA 樣品的提取及 cDNA 文庫構建和測序使用

用RNAiso Reagent對日本七鰓鰻復合免疫實驗組及對照組鰓囊總 RNA進行提取。將符合測序標準的總 RNA 樣本委托北京諾禾致源生物信息科技公司進行雙向測序及分析。

1.1.2 轉錄本的拼接

先去除測序后數(shù)據(jù)中比例大于10%的含N的原始序列的讀書（N 為不能確定的堿基序列）、低質量的讀數(shù)得到純凈讀數(shù)。運用短序列拼接的 Trinity 軟件進行拼接。

1.1.3 轉錄組數(shù)據(jù)處理與注釋分析

利用 Blast 軟件，將 Unigene在 Nr 蛋白序列數(shù)據(jù)庫中進行序列比對。未注釋的Unigene 在 Nt 核酸序列數(shù)據(jù)庫中所搜索到的為同源序列。將 e 值（e-value）的閾值設置為小于1E-10并運用 HMMER3 程序，根據(jù) Pfam數(shù)據(jù)庫中已構建好了的蛋白結構域 HMM統(tǒng)計模型，對 Unigene 進行注釋。

1.1.4 基因差異表達分析

以拼接得到的 Unigene 序列作為標準參考序列，應用軟件 Bowtie將每個樣品的純凈讀數(shù)與標準參考序列進行比對。將Bowtie 比對的數(shù)據(jù)結果利用RSEM軟件進行統(tǒng)計，進一步得到了每個樣品與每個Unigene的純凈度數(shù)數(shù)量進行比對，通過進行 FPKM 轉換來估算基因的基因表達水平?；虿町惐磉_的輸入數(shù)據(jù)為基因表達水平分析中得到的讀數(shù)數(shù)量數(shù)據(jù)進行標準統(tǒng)一化處理。

2 結果與分析

2.1 七鰓鰻鰓轉錄組測序序列的轉錄本拼接及注釋

對實驗獲得的對照組和實驗組兩個 cDNA 文庫進行雙向測序分別得到的原始數(shù)據(jù)進行過濾，Q20和 Q30指標分別高于 96%和 90%，因此測序結果良好。

2.2 七鰓鰻鰓組織中被復合抗原刺激后精氨酸和脯氨酸代謝有關酶的甄選

對參與精氨酸和脯氨酸代謝過程中有關酶進行分析，發(fā)現(xiàn)這5個與精氨酸代謝通路相關度較高的5個Unigene。根據(jù)統(tǒng)計：精氨酸酶、精氨酸N-甲基轉移酶、肌酸激酶、鳥氨酸脫羧酶1、胍丁胺酶的表達量均出現(xiàn)下調的趨勢，精氨酸酶和肌酸激酶的表達量降低顯著。

3、討論

精氨酸能夠催化L-精氨酸水解生成鳥氨酸與尿素反應的酶。鳥氨酸是合成多胺類物質的前體，日本七鰓鰻機體被復合抗原刺激后精氨酸酶的表達量明顯降低，說明抑制了精氨酸的進一步分解為鳥氨酸，繼而阻斷了鳥氨酸循環(huán)。七鰓鰻在被復合抗原刺激后，其機體的T淋巴細胞的免疫應答增加。肌酸激酶在精氨酸代謝途徑中是精氨酸代謝的一個中間產(chǎn)物產(chǎn)生所需要的酶，精氨酸在甘氨酸氨基轉移酶（GATM）作用下生成胍基乙酸，其在胍乙酸N-甲基轉移酶（GAMT）作用下生成了肌酸[5]，繼而在肌酸激酶的作用下生成磷酸肌酸。在本研究中肌酸激酶的表達量明顯降低，其抑制了肌酸的進一步分解，而胍基乙酸可以在甘氨酸氨基轉移酶的作用下合成精氨酸，保證了七鰓鰻在受到病原微生物侵襲時精氨酸濃度高以幫助七鰓鰻機體更快恢復正常水平。本文通過轉錄組測序技術，發(fā)現(xiàn)了日本七鰓鰻再被復合抗原刺激后，精氨酸代謝相關酶的表達量都呈現(xiàn)出不同程度的降低。此外，其他的研究表明，精氨酸可作為一種營養(yǎng)物質幫助動物抗逆，那精氨酸是否能幫助七鰓鰻抗逆有待于進一步研究。

參考文獻

[1]Pancer Z，Amemiya CT，Ehrhardt GRA，etc.Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey.[J].Nature，2004，430（6996）：147-180.

[2]Pancer Z，Saha NR，Kasamatsu J，etc.Variable lymphocyte receptors in hagfish.[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（26）：9224-9229.

[3]Grabherr MG，Haas BJ，Yassour M，etc.Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.[J].Nat Biotechnol，2011，29（7）：644-652.

[4]王麗麗，朱 禎，李 霞.精氨酸甲基轉移酶及其生物學功能研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2008，24（7）：39-44.

[5]謝東輝，冷雙，謝珂，等.胍丁胺酶與相關疾病關系的研究進展[J].生命的化學，2018，38（4）：603-607.