林輝鋒 莫智龍 陳昌銘

摘 要：為探尋墨蘭瓶內誘導假鱗莖形成和生長膨大的最佳配方組合，以墨蘭組培苗為材料，研究不同基礎培養(yǎng)基種類、蔗糖濃度、pH值、激素組合對蘭屬墨蘭假鱗莖形成和生長的影響。結果表明：誘導墨蘭假鱗莖形成和促進其生長的最佳基本培養(yǎng)基為N6、蔗糖濃度30 g·L-1、pH 5.2、激素組合6BA 0.1 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1。該研究結果可促進墨蘭組培苗假鱗莖的形成及生長，提高幼苗成活率、縮短種苗栽培時間。

關鍵詞：墨蘭;假鱗莖;誘導;生長;培養(yǎng)基

Abstract：In order to explore the best formula combination for inducing the formation and growth expansion of Cymbidium sinense in the bottle， the effects of different types of basal culture medium， sucrose concentration， pH value and hormone combination on the formation and growth of Cymbidium sinense were studied. The results showed that the optimal formula combination for inducing the formation and growth of Cymbidium sinense pseudobulb was that basic culture medium of N6， sucrose concentration of 30 g·L-1， pH value of 5.2， and hormone combination of 6BA 0.1 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1. The results could promote the formation and growth of tissue culture seedling pseudobulb of Cymbidium sinense， improve the survival rate of seedlings and shorten the cultivation time of seedlings.

Key words：Cymbidium sinense; Pseudobulb; Induce; Growth; Culture medium

墨蘭Cymbidium sinense，別稱報歲蘭、拜歲蘭，隸屬蘭科蘭屬地生蘭，原產我國臺灣、福建南部、廣東、廣西等地，為七大類傳統(tǒng)國蘭之一。其葉片形態(tài)獨特飄逸，花序直立，花量大，花色素雅，花瓣幽香四溢，有“花中君子”之美稱，深受消費者的喜愛。同時，墨蘭的根還具有一定的平喘藥用功效[1]，其花亦可提取精油[2]，做一些美容化妝品。墨蘭集觀賞、藥用和經濟價值為一體，為我國出口量最大的國蘭種類[3]。

傳統(tǒng)采用對野生蘭花的大量挖掘和分株進行國蘭種苗繁育，因其破壞種質資源、繁殖系數(shù)小、生長周期慢等特點，遠遠不能滿足膨脹的蘭花市場需求[4]，植物組織培養(yǎng)能有效緩解當前的狀況[5]。自1973年科研人員通過建蘭進行組織培養(yǎng)成功獲得無菌植株，之后相繼建立了春蘭、墨蘭等組織培養(yǎng)快速繁殖無性系[6-7]，當前國內在國蘭組培快繁體系研究上較為完善。假鱗莖是蘭科植物特有的變態(tài)莖，能夠長出葉芽與花芽，并且儲存水分與養(yǎng)分[8]，假鱗莖的興衰可直接影響蘭花的生長。謝玲超等[9]報道了通過假鱗莖出芽萌生龍根，再由龍根頂芽分生出葉和假鱗莖組織，最后發(fā)育成蘭株的地上組織的蘭花假鱗莖繁殖技術，進一步探討了不同栽植期、不同種類蘭花對假鱗莖成苗時間長短的影響，但主要體現(xiàn)在室外栽培上。室內關于蘭科植物假鱗莖方面的組培研究主要集中在白芨方面，李慧敏等[10]通過研究得出假鱗莖在促進白芨組培苗成活率的提高、生育周期的縮短方面效果顯著。孫宇龍[11]為了探究組織培養(yǎng)中白芨假鱗莖的誘導和增大的最佳培養(yǎng)基配方，進行了單因素試驗和多因素正交試驗，并得出了最佳培養(yǎng)基配方。國蘭假鱗莖的組培研究上，僅有湯訪評[12]研究了通過形態(tài)解剖研究黑暗處理條件下春蘭組培苗的假鱗莖發(fā)育，觀察了假鱗莖伸長、發(fā)育形成根狀莖，其形態(tài)未有變化。在本實驗室前期的組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，擁有假鱗莖的組培苗生長情況明顯較好、死亡率較低，誘導假鱗莖的形成在提高國蘭組培苗質量方面效果顯著，能有效提高組培苗的成活率。因此，研究探尋墨蘭瓶內誘導假鱗莖形成和生長膨大的最佳配方組合，對提高幼苗成活率、縮短種苗栽培時間都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試墨蘭組培苗來自三明市農業(yè)科學研究院花卉研究所，組培種苗規(guī)格為高度6 cm，帶根3條。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響 試驗設計基本培養(yǎng)基分別為：N6、B5、MS、1/2MS、花寶1號4 g·L-1、花寶1號3 g·L-1。每種基本培養(yǎng)基內附加活性炭1 g·L-1、香蕉泥50 g·L-1。每種培養(yǎng)基3瓶，每瓶接種5株幼苗，重復3次。置于溫度23～25℃，光強1800 lx，光照時間16 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.2 不同蔗糖濃度對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響 試驗設計以N6為基本培養(yǎng)基，設置蔗糖濃度梯度為0、10.0、20.0、30.0、40.0 g·L-1。培養(yǎng)基內附加活性炭1 g·L-1、香蕉泥50 g·L-1。每種培養(yǎng)基3瓶，每瓶接種5株幼苗，重復3次。置于溫度23～25℃，光強1800 lx，光照時間16 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.3 不同pH值對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響 試驗設計以N6為基本培養(yǎng)基，設置pH梯度為5.4、5.2、5.0、4.8、4.5。培養(yǎng)基內附加活性炭1 g·L-1、香蕉泥50 g·L-1。每種培養(yǎng)基3瓶，每瓶接種5株幼苗，重復3次。置于溫度23～25℃，光強1800 lx，光照時間16 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.4 不同種類激素組合對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響 試驗設計以N6為基本培養(yǎng)基，添加6BA、ZT、NAA 3種激素，采用三因素三水平的正交試驗設計（表1），共9個處理。培養(yǎng)基內附加活性炭1 g·L-1、香蕉泥50 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH 5.2。每種培養(yǎng)基3瓶，每瓶接間16 h的培養(yǎng)種5株幼苗，重復3次。置于溫度23～25℃，光強1800 lx，光照時室中培養(yǎng)。

1.2.5 觀察測量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 待培養(yǎng)90 d后，從培養(yǎng)瓶內移出組培苗，在操作臺上去除組培苗上附著的培養(yǎng)基等殘留物，用無菌水清洗過后用游標卡尺測量假鱗莖粒徑，并計算誘導率。得到的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析處理。假鱗莖粒徑、平均粒徑及平均誘導率的計算方法：

2 結果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響

從表2可以看出，6種基本培養(yǎng)基在誘導組培苗假鱗莖形成方面存在著極顯著差異，其中誘導組培苗假鱗莖形成效果最好的是N6，誘導率達到55%，6種基本培養(yǎng)基對假鱗莖的誘導效果依次為N6>花寶1號4 g·L-1>B5>MS>花寶1號3 g·L-1>1/2MS;MS、花寶1號4 g·L-1、花寶1號3 g·L-1在促假鱗莖生長方面差異不顯著，因此對促進假鱗莖生長膨大影響的差異不大。6種基本培養(yǎng)基對促進假鱗莖生長膨大的效果依次為N6>B5>花寶1號4 g·L-1>花寶1號3 g·L-1>MS>1/2MS。由此可見，墨蘭假鱗莖誘導較佳基礎培養(yǎng)基為N6。

2.2 不同蔗糖濃度對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響

從表3可以看出，組培苗假鱗莖的誘導率隨著蔗糖濃度的提升不斷提高，假鱗莖的平均粒徑隨著蔗糖濃度的提高出現(xiàn)先升高后下降的情況。當蔗糖濃度為20、30 g·L-1時，假鱗莖粒徑達到最大，兩者差異不顯著，在假鱗莖誘導率上，蔗糖濃度30 g·L-1顯著大于20 g·L-1，因此研究認為蔗糖濃度30 g·L-1是較為適合的假鱗莖誘導和生長蔗糖濃度，在此濃度下，組培苗假鱗莖的誘導率高，并能很好地促進假鱗莖的生長發(fā)育。

2.3 不同pH值對墨蘭假鱗莖誘導及其生長影響

從表4可以看出，在誘導率上，pH 5.4、5.2、5.0時假鱗莖的誘導率不存在顯著性差異，pH 4.8、4.5同樣不存在顯著性差異，隨著pH值的降低，假鱗莖的誘導率呈現(xiàn)下降趨勢。而在粒徑上，所設定的pH值對假鱗莖的膨大生長不存在顯著性差異。綜合數(shù)據(jù)分析，pH 5.2為誘導假鱗莖及其生長較適合的pH值。

2.4 不同激素組合對誘導假鱗莖及其生長的影響

從表5可以看出，根據(jù)正交設計的方差分析，以誘導率為目的時，3種激素的主效作用6BA>NAA>ZT。以粒徑為目的時，3種激素的主效作用6BA>ZT>NAA，進一步多重比較分析（表5），當激素組合6BA 0.1 mg·L-1、ZT 0.5 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1時，是誘導假鱗莖形成并促進其生長的最佳激素濃度，其誘導率可達90.33%，粒徑達12.36 mm。

3 討論與結論

假鱗莖是蘭花儲存養(yǎng)分和水分的器官，花芽和葉芽都著生在假鱗莖的基部根莖部分，假鱗莖的大小可直接影響蘭花生長壯弱[13]。假鱗莖的大小受蘭花品種、植株健壯度等影響[14]。培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中試驗材料生存和發(fā)育的根基，猶如栽培植物的土壤和施用的肥料[15]，對離體蘭花器官和組織細胞的生長至關重要。其主要由無機鹽、有機化合物和復合添加物組成，不同植物對營養(yǎng)的需求隨植物種類不同而有變化。本試驗研究N6、B5、MS、花寶1號4 g·L-1、花寶1號3 g·L-1作為基本培養(yǎng)基對墨蘭假鱗莖誘導及其生長的影響，結果表明N6培養(yǎng)基是對墨蘭假鱗莖誘導較適宜培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基為蘭花組織培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基，能滿足大多數(shù)蘭花組織培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，其鉀鹽、銨鹽含量較高，為高鹽成分培養(yǎng)基。因此，采用MS培養(yǎng)基進行蘭花組織培養(yǎng)有時顯得營養(yǎng)過剩。B5和N6為高硝酸鹽培養(yǎng)基，B5含較高的鹽酸硫胺素和較低的氨態(tài)氮，在蘭花培養(yǎng)上適用于發(fā)芽和壯苗培養(yǎng);N6培養(yǎng)基最初是為培養(yǎng)禾谷類植物花藥和花粉設計的，其優(yōu)點是培養(yǎng)基的組成成分比較簡單，能基本滿足蘭花假鱗莖生長過程中對于營養(yǎng)元素供給的要求。而花寶1號為設施栽培培育種苗常用的肥料，本研究結果表明隨著花寶1號施用量增加，蘭花假鱗莖誘導率顯著提高，而粒徑表現(xiàn)差異不顯著，這可能與花寶1號中的氮含量較少所致，建議在用花寶1號為基本培養(yǎng)基時可適當添加硝酸銨以平衡氮素含量。

植物組織培養(yǎng)過程中的碳源主要來源是培養(yǎng)基添加蔗糖，有時也會使用麥芽糖或乳糖，果糖和葡萄糖則見少量使用[16]。組培苗的生長情況在不同的糖濃度影響下也是不同的，糖類不僅能提供組培苗生長發(fā)育過程中所需要的能量，而且還具有調節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用，使培養(yǎng)基的滲透壓始終保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。本研究結果表明30 g·L-1是較為適合假鱗莖誘導和生長的蔗糖濃度，在此濃度下，組培苗假鱗莖的誘導率較高，且有利于假鱗莖生長發(fā)育。自然界中蘭花生長于偏酸性、腐殖質豐富的土壤中，成株栽培最佳pH范圍為4.5～5.5，蘭花原球莖在偏酸性的條件下生長較好。國蘭組培時對培養(yǎng)基pH較為敏感，培養(yǎng)基pH值一般在5.1～5.4范圍內[14]。本研究結果顯示pH 5.2是較為適合的pH值，有利于假鱗莖的誘導與促進其生長膨大，與前人報道一致。

植物激素是一類小分子的簡單有機化合物，具有十分復雜、多樣的生理效應，在植物的生長發(fā)育上發(fā)揮著很大的調節(jié)功能[17]。不同的激素組合搭配使用的效果不同，相同的激素組合搭配時用量不同，其效果也不同。不同用量的配比對組培苗生長發(fā)育的影響存在差異，如常見的生長素（NAA）與細胞分裂素（BA）配合使用時，如果NAA含量較多，則芽的分化受到促進，如6BA含量較多，則有利于類原球莖的增殖與根的形成。本研究結果發(fā)現(xiàn)，當6BA濃度為0.1 mg·L-1、ZT濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1時，組培苗假鱗莖的誘導率最高，達90.33%;以濃度0.5 mg·L-1ZT與濃度0.1 mg·L-1NAA兩者搭配，對促進組培苗假鱗莖的生長效果最好，粒徑達到13.28 mm。6BA對誘導假鱗莖的形成效果最好，對促進假鱗莖的生長效果不明顯。

綜上所述，本研究針對墨蘭假鱗莖瓶內誘導及其生長的影響因素進行研究，篩選出墨蘭假鱗莖瓶內誘導及其生長的最佳基本培養(yǎng)基為N6、蔗糖濃度30 g·L-1、pH 5.2、激素組合6BA 0.1 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 g·L-1。在此條件下蘭花組培苗假鱗莖的誘導效果最佳，生長膨脹情況最好。

參考文獻：

[1]柯文明，關見留，曾曉春.墨蘭的急性毒性和平喘的初步研究[J].廣東教育學院學報，2004，24（2）：87-89.

[2]李杰，王再花，章金輝，等.墨蘭品種‘企黑’的花朵精油成分分析[J].熱帶作物學報，2016，37（1）：86-91.

[3]謝利，王芬，曾瑞珍， 等.農桿菌介導的墨蘭遺傳轉化[J].生物工程學報，2015，31（4）：542-551.

[4]凌曉祺.國蘭花期調控與組培快繁技術優(yōu)化的研究[D].杭州：浙江大學，2016.

[5]程芬芳，陳新榮，陳瑩瑩，等.墨蘭的組織培養(yǎng)研究進展[J].黑龍江農業(yè)科學，2015（3）：155-159.

[6]余道平.春蘭組織培養(yǎng)技術體系研究[D].成都：四川農業(yè)大學，2005.

[7]周輝明，林輝鋒，尚偉，等.垂花蕙蘭種子無菌播種和快速繁殖[J].福建農業(yè)學報，2013， 28（10）：18-22.

[8]張毓，張佐雙，趙世偉.世界觀賞蘭花[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，2004.

[9]謝玲超，單筱玲，邰雁眉，等.蘭花假鱗莖繁殖技術研究初報[J].現(xiàn)代園藝，2007（2）：13.

[10]李慧敏，楊冠海，李明靜，等.白芨瓶內假鱗莖誘導研究[J].南方農業(yè)學報，2013， 44（10）：1607-1612.

[11]孫宇龍.白及的假鱗莖誘導、遺傳資源鑒定與評價的研究[D].南京：南京師范大學，2015：4，11-18.

[12]湯訪評.黑暗條件下春蘭組培苗假鱗莖發(fā)育的形態(tài)解剖研究[C]//中國觀賞園藝研究進展，北京：中國林業(yè)出版社，2013：274-277.

[13]王春華.怎樣甄別蘭草的壯弱[J].花卉，2007（9）：14.

[14]李子紅，賈燕.珍品蘭花快速繁殖與養(yǎng)護[M].上?？茖W技術出版社，2006.

[15]余道平.春蘭組織培養(yǎng)技術體系研究[D].成都：四川農業(yè)大學，2005.

[16]丁燕芬，王巖，龍春林.中國蘭花組織培養(yǎng)研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2007（8）：2247-2248，2250.

[17]傅向東，錢秀紅，毛碧增，等.幾種理化因子對建蘭原球莖生長分化的影響[J].浙江農業(yè)大學學報，1997（5）：65-68.

（責任編輯：柯文輝）