鄒建軍，蘇珊，曾云云，張賢蘭，謝亞琳，蘇寧，岑文昌

(廣州市胸科醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)告顯示，世界癌癥患者和死亡病例每年都在不斷增加，近一半新增癌癥病例出現(xiàn)在亞洲，而中國(guó)占大多數(shù)，并且新增癌癥病例高居全球首位[1-2]。肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,目前全球原發(fā)性肺癌發(fā)病率位居癌癥發(fā)病第6位，死亡率位居癌癥死亡率第3位，極大地威脅著人們的生命和健康[3]。多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，不能手術(shù)切除[4]，所以化療是一種可供選擇的治療方法，然而，肺癌對(duì)化療藥物敏感性極低，其治療仍是臨床難點(diǎn)[5]。紫杉醇是一種常見(jiàn)的化療藥物，其較低劑量即可達(dá)到抑制癌基因的效果，然而紫杉醇最大的缺點(diǎn)是水溶性差、副作用大及低滲透性[6-7]。因此，尋找一種適合的載體以期能解決以上問(wèn)題。納米銀(AgNPs)具有高穩(wěn)定性和滲透性的特點(diǎn)，可作為良好的藥物載體[8]。因此，本研究設(shè)計(jì)將納米銀運(yùn)載紫杉醇，使紫杉醇高效地進(jìn)入細(xì)胞膜，并評(píng)估其抗癌效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

紫杉醇(PTX)、硝酸銀(AgNO3)、維生素C(vitamin C)、碘化丙啶(PI)、 DAPI染色液、噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。主要使用的儀器為納米粒度電位儀(Zetasizer 3000HS,英國(guó)馬爾文公司)及透射電鏡(H-7650,日本日立公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549人肺癌細(xì)胞及HK-2人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞購(gòu)于ATCC公司。細(xì)胞接種于含10%(φ)胎牛血清(Gibco，美國(guó))和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，于37 ℃，5%(φ)CO2培養(yǎng)。

1.3 功能化納米銀的制備及表征

配制400 μg/mL的維生素C溶液， 取100 μL逐滴滴加到4 mL AgNO3溶液中，攪拌1.5 h后，透析純化得到AgNPs溶液。取上述AgNPs溶液，加入 PTX， 攪拌1 h后10 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀用去離子水洗3遍，冷凍干燥后得到AgNPs運(yùn)載PTX的納米載藥體系。采用納米粒度電位儀檢測(cè)AgNPs負(fù)載PTX的粒徑和電位； 透射電鏡用于觀察AgNPs負(fù)載PTX納米顆粒形貌變化。

1.4 AgNPs運(yùn)載PTX對(duì)細(xì)胞毒性檢測(cè)

A549細(xì)胞和HK-2細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。分別測(cè)定不同藥物組對(duì)A549及HK-2細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率用MTT法進(jìn)行測(cè)定。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以4×104個(gè)/mL和5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基各100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。加入 MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，37 ℃孵育5 h后吸棄培養(yǎng)板孔中的液體，加入 DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，紫色結(jié)晶物充分溶解后，測(cè)定各孔A570值。以無(wú)任何處理的細(xì)胞組為對(duì)照組，其A570為100%，計(jì)算藥物處理組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A570實(shí)驗(yàn)組/A570對(duì)照組)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

藥物處理后細(xì)胞周期的變化采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將6×104個(gè)A549細(xì)胞接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，加入AgNPs、PTX、Ag@PTX，48 h后將細(xì)胞消化并和上清一同離心1 200 r/min,6 min,加入1 mL預(yù)冷的70%(φ)乙醇重懸， -20 ℃放置過(guò)夜固定。次日，離心收集細(xì)胞，PBS洗3次，加500 μL PI。工作液避光染色15 min。采用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物處理48 h后，用PBS洗滌1次，4%(φ)多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS洗滌1次。 加入0.3%Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min。然后樣品上加50 mL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min， DAPI染色30 min。再用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件分析，不同處理組之間細(xì)胞生存率的比較采用多個(gè)樣本率的卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ag@PTX體系的制備和表征

如圖1。A圖為電鏡下觀察AgNPs、PTX修飾的納米銀(Ag@PTX)，可見(jiàn)Ag@PTX為均勻、分散的球狀顆粒。B圖為兩種組分的粒徑大小，C圖是兩種組分的電位分析，其中Ag@PTX為正電位，有利于進(jìn)入細(xì)胞。B圖和D圖的大小分布圖，提示Ag@PTX在30 d內(nèi)能穩(wěn)定于2～2.5 nm大小，此小尺寸將同樣有利于顆粒進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。

2.2 Ag@PTX對(duì)A549細(xì)胞活性的抑制作用

用MTT法檢測(cè)經(jīng)AgNPs、 PTX及 Ag@PTX處理后的A549細(xì)胞增殖情況。圖2A是各藥物組處理后的細(xì)胞形貌變化，可以看出，Ag@PTX組明顯抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞數(shù)量減少。經(jīng)AgNPs、PTX及Ag@PTX處理后，A549細(xì)胞存活率分別為： 83%、75%及27%。經(jīng)2.5、5、10 μg/mL不同濃度Ag@PTX處理后，A549細(xì)胞組存活率分別為65%， 26%及13%，HK-2細(xì)胞存活率分別為97%、95%及94%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，HK-2細(xì)胞比A549細(xì)胞生存率高，表明Ag@PTX對(duì)肺癌A549細(xì)胞有抑制作用，但對(duì)HK-2細(xì)胞抑制較弱。此外，不同藥物組HK-2細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明Ag@PTX對(duì)正常細(xì)胞毒性低。

AB252015105Number/%總數(shù)Ag@PTX?104AgNPsAgNPsAg@PTX20151050-1002001000100011000D/nm3.02.52.01.51.00.50D/nm0248102030U/mVt/dCDAg@PTXAgNPs

A、B、C、D分別是AgNPs、Ag@PTX的透射電鏡、電位、粒徑分布及穩(wěn)定性圖。

圖1Ag@PTX的表征
Figure1Characterization of Ag@PTX

ControlAgNPsPTXAg@PTX1209060300細(xì)胞生存率/%ConAgNPsPTXAg@PTXA549HK-2Con2.5510ABC*********ρ(Ag@PTX)/(μg?mL-1)

A.不同組分在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形貌; B.不同處理組細(xì)胞存活率(其中AgNPs的濃度是2.5 μg/mL,PTX的濃度為5 μg/mL)； C.不同濃度的Ag@PTX處理后的細(xì)胞存活率。與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2Ag@PTX對(duì)A549細(xì)胞存活率作用
Figure2Effects of Ag@PTX on the growth of A549 cells

2.3 細(xì)胞周期阻滯與DNA片段化改變

細(xì)胞凋亡晚期，內(nèi)源性核酸酶被激活，胞內(nèi)DNA降解并溢出胞外，胞內(nèi)總DNA降低。通過(guò)碘化丙啶染色，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析Ag@PTX 細(xì)胞凋亡及周期分布的影響。從圖3A數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)AgNPs、PTX及Ag@PTX處理后， Sub-G1期分別上升為13.1%、21.8%、27.4%，說(shuō)明Ag@PTX能有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)生染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂，產(chǎn)生大量DNA片段。TUNEL能與DNA 3′末端特異性結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，細(xì)胞核在DAPI染色后呈藍(lán)色熒光。如圖3B所示，經(jīng)AgNPs、PTX及Ag@PTX處理后，Ag@PTX較其他處理組A549細(xì)胞出現(xiàn)更明顯綠色熒光，說(shuō)明DNA發(fā)生降解；細(xì)胞核在藍(lán)色熒光DAPI染色后提示細(xì)胞核發(fā)生固縮。以上結(jié)果說(shuō)明Ag@PTX能有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

ControlAgNPsPTXAg@PTXControlAgNPsPTXAg@PTXTUNELDAPIMergeAB

A.用流式細(xì)胞術(shù)分析不同組分藥物處理后，A549細(xì)胞凋亡及周期分布的影響； B.染色質(zhì)濃縮和DNA斷裂程度。(DAPI染色)

圖3Ag@PTX誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡
Figure3A549 cell apoptosis induced by Ag@PTX

3 討論

納米科技和納米醫(yī)學(xué)研究具有廣闊的應(yīng)用前景[9]，常用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤藥物及示蹤劑等。納米顆粒擁有宏觀物質(zhì)所不具有的優(yōu)良特性，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子效應(yīng)，顯示出不同于常規(guī)材料等特性。國(guó)內(nèi)外對(duì)AgNPs在抗菌作用方面的研究報(bào)道較多[10],AgNPs作為金屬納米材料的代表，普遍運(yùn)用在醫(yī)療領(lǐng)域[11]。在臨床泌尿外科、婦科、骨外科、皮膚科和燒燙傷外科治療中[11]，AgNPs具有持久高效的抗環(huán)境病原菌作用，然而AgNPs作為抗腫瘤藥物載體的研究報(bào)告還比較少。PTX是細(xì)胞周期非特異的細(xì)胞毒性藥物[12]，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，并且在低濃度即可發(fā)揮抗癌效應(yīng)。然而PTX的應(yīng)用受限于其水溶性差、低滲透性和嚴(yán)重的副作用[13]。

本研究將AgNPs運(yùn)載PTX，制備出了形貌規(guī)則、小粒徑、分散均勻的Ag@PTX納米顆粒(2～2.5 nm)，使PTX更容易、更高效地進(jìn)入細(xì)胞膜。MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在相同PTX濃度下Ag@PTX比單獨(dú)PTX更有效地抑制A549細(xì)胞增殖。而通過(guò)對(duì)正常細(xì)胞的control組和不同濃度Ag@PTX處理組間細(xì)胞活性的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明AgNPs運(yùn)載的PTX對(duì)正常細(xì)胞的毒性低。此外，Ag@PTX處理組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出較多A549細(xì)胞體積變小、皺縮、變圓及脫落，在細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)生染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂，產(chǎn)生大量DNA片段。TUNEL能與DNA 3′末端特異性結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光，細(xì)胞核在DAPI染色后呈藍(lán)色熒光。Ag@PTX較PTX組A549細(xì)胞出現(xiàn)更明顯綠色熒光，表明Ag@PTX有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中Ag@PTX組凋亡峰也比單獨(dú)的PTX組更明顯。這些結(jié)果均表明Ag@PTX比單獨(dú)PTX更有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

總之，Ag@PTX納米顆粒能有效抑制A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制。 Ag@PTX有可能成為抗腫瘤治療一個(gè)新的候選。