任凌燕 ，陳 楠 ，徐 剛

（1.重慶科技學(xué)院安全工程學(xué)院，重慶 401331；2.工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331）

目前，糖尿病嚴(yán)重威脅著人類的健康。2017年國際糖尿病聯(lián)盟公布目前全球共有4.25億成人糖尿病患者，中國成人糖尿病患者人數(shù)高達(dá)1.14億，位居世界第一，占總數(shù)的1/4以上[1]。而中國糖尿病的患病率2013年達(dá)到10.9%，僅次于美國（13%）[2]。隨著人們對中草藥多糖研究的深入，利用其開發(fā)制作安全經(jīng)濟(jì)、具有降血糖保健功能的天然食品引起廣大學(xué)者的持續(xù)關(guān)注。

袋泡茶因其具有沖泡快速方便、清潔衛(wèi)生、用量標(biāo)準(zhǔn)的特點(diǎn)，可橫跨茶飲料、保健品、藥茶三大行業(yè)。其中以茶為原料，傳統(tǒng)中草藥為主要成分的保健袋泡茶正適應(yīng)了現(xiàn)代人們快節(jié)奏生活工作和保健養(yǎng)生的需要。降糖袋泡茶以綠茶為基礎(chǔ)，與生黃芪、玉米須、萆薢、知母、荷葉、桑葉、葛根等多味中草藥混合組成，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其對糖尿病患者日?？刂蒲蔷哂辛己眯Ч?。我們通過前期藥理研究已發(fā)現(xiàn)，該降糖袋泡茶對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠具有明顯的降糖作用[3]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，其袋泡茶中黃芪多糖[4]、玉米須多糖[5]、知母多糖[6]、桑葉多糖[7]、葛根多糖[8]、綠茶茶多糖[9]等均具有不同程度的降血糖作用。因此，研究降糖袋泡茶總多糖含量水平的高低，可為降糖袋泡茶的后續(xù)開發(fā)和質(zhì)量控制提高一定的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器：紫外分光光度計(jì)（UV-1100上海美譜達(dá)儀器有限公司）、13S223S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限責(zé)任公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料：降糖袋泡茶（生黃芪、玉米須、荷葉、葛根等中藥飲片購自重慶桐君閣飲片有限責(zé)任公司，打粉后于綠茶混合自制成袋泡茶）；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所，110833-201707）。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取105℃干燥至恒重D-無水葡萄糖100mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得1.000mg/ml的葡萄糖溶液。精密移取此溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置于 100ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密量取2.0ml各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至15ml具塞試管中，沿著各試管壁緩慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸試劑，搖勻后蓋緊振搖，沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻30min，另取2.0ml蒸餾水，加蒽酮-硫酸試劑，同上操作作為空白對照，在620nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蒽酮-硫酸試劑的配制：稱取蒽酮0.2 g，緩慢加入100ml濃硫酸，邊加邊攪拌至黃色透明液，避光保存在棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配，如有結(jié)晶析出，可稍加熱溶解。

1.2.3 樣品溶液的制備及測定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g置于250ml圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，過濾，殘?jiān)?0%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘?jiān)鼡]干，用30ml蒸餾水每次回流1小時，回流2次，過濾，殘?jiān)谜麴s水洗滌3次，濾液置于250ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，再取20.0ml至100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為降糖袋泡茶總多糖樣品溶液。

精密量取樣品溶液2.0ml至15ml具塞試管中，照“1.2.1”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法操作，依法測定吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中多糖的含量。

1.2.4 檢測波長的選擇：精密移取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液2.0ml至15ml具塞試管中，沿著各試管壁緩慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸試劑，搖勻后蓋緊振搖，沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻30min，同上操作作為空白對照，在400-800nm的波長范圍內(nèi)掃描。另精密移取樣品溶液2.0ml，按相同方法顯色后在400-800nm的波長范圍內(nèi)掃描。同時按相同方法配置不顯色的樣品溶液，在相同波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)葡萄品溶液和樣品溶液經(jīng)顯色后在波長620±1nm處均有最大吸收，未顯色的樣品溶液幾乎無吸收。因此，選擇620nm為降糖袋泡茶總多糖的測定波長。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍：分別精密量取2.0ml各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至15ml具塞試管中，按“1.2.1”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=14.234x-0.0044，相關(guān)系數(shù)為0.9991，葡萄糖在0.01-0.08mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.6 精密度試驗(yàn)：精密吸取葡萄糖對照品溶液2.0ml，按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在620nm處測定吸光度，連續(xù)測定5次，并計(jì)算RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，RSD為0.11%，說明該方法精密度好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)：在同一樣品溶液中分別移取2.0ml，平行5份，按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在620nm處測定吸光度，求RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，RSD為0.13%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：移取同一供試品溶液2.0ml，按“1.2.1”項(xiàng)下方法，分別在室溫下放置 30、60、90、120、150min 時，在 620nm處測定吸光度（n=5），并計(jì)算RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，RSD為0.58%，由此可見，溶液在顯色冷卻后150min內(nèi)穩(wěn)定性好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

1.2.9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)：精密稱取已知濃度為61.01mg/g的樣品粉末1.0g，共5份，分別放入250ml圓底燒瓶中，精密加入無水葡萄糖對照品10.1mg，按“1.2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液，然后按“1.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算回收率以及RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，回收率平均值為98.19%，RSD=3.30%。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

1.2.10 樣品的測定：精密稱取降糖袋泡茶樣品粉末約1.0g，共5份，按“1.2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液和測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5，降糖袋泡茶中多糖的平均含量為6.08%。

表5 降糖袋泡茶中多糖含量測定結(jié)果

2 討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 樣品回流時間的確定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流60min，過濾，殘?jiān)?0%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘?jiān)鼡]干。三份樣品用蒸餾水分別回流30min、60min和90min。回流完畢，用250ml容量瓶定容，分別取20ml再定容成100ml。然后按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在620nm處測定吸光度值。結(jié)果見表6，顯示回流60min時，多糖提取基本完全。

表6 不同回流時間下樣品溶液的吸光度值

2.1.2 樣品回流溶劑量的確定：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流提取60min，過濾，殘?jiān)?0%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘?jiān)鼡]干。三份樣品分別加20、30、40ml的蒸餾水當(dāng)溶劑，回流60min后，抽濾，用蒸餾水洗滌濾渣3次后，分別將溶液定容成 250ml，取 20.0ml再定容成 100ml，然后按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在620nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，顯示提取溶劑量為30ml時多糖提取基本完全。

表7 不同溶劑量下樣品溶液的吸光度值

2.1.3 樣品回流提取次數(shù)的選擇：精密稱取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250ml圓底燒瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，過濾，殘?jiān)?0%乙醇-蒸餾水洗滌3次，收集殘?jiān)鼡]干。殘?jiān)謩e用30ml蒸餾水每次回流60min，三份樣品分別回流1次、2次、3次?；亓魍瓿闉V，用蒸餾水洗滌濾渣后，用250ml容量瓶定容，取20.0ml再定容成100ml，然后按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在620nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8，顯示回流提取2次時多糖提取基本完全。

表8 不同提取次數(shù)下樣品溶液的吸光度值

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 反應(yīng)溫度的確定：精密移取對照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸試劑，按“1.2.1”項(xiàng)下方法，分別選擇在 40℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴鍋中加熱10min，隨行作空白，然后在620nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，當(dāng)反應(yīng)溫度為100℃時，測定的吸光度值最大，因此顯色反應(yīng)最佳溫度為100℃。

2.2.2 反應(yīng)時間的確定：精密吸取對照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸試劑，按“1.2.1”項(xiàng)下方法，在沸水浴中加熱，加熱時間分別為 5、8、10、15、20min，隨行作空白，然后在 620nm 處測定吸光度。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2，當(dāng)反應(yīng)時間選擇10min時測得的吸光度值最大，因此顯色反應(yīng)的時間確定為10min。

圖1 不同反應(yīng)溫度測得的吸光度值

圖2 不同反應(yīng)時間測吸光度值

3 討論

本文建立的蒽酮-硫酸法測定降糖袋泡茶總多糖含量方法準(zhǔn)確、可靠，可用于該降糖袋泡茶總多糖的質(zhì)量控制。