周囡囡 王友翠 黃玉菊 謝俊霞

[摘要]?目的?探討神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）與嗅鞘細(xì)胞（OECs）聯(lián)合移植對(duì)帕金森?。≒D）大鼠運(yùn)動(dòng)行為及非運(yùn)動(dòng)行為的影響。

方法取孕11～12 d胎鼠中腦組織培養(yǎng)NSCs并鑒定，取出生1～3 d乳鼠嗅球培養(yǎng)OECs并鑒定。采用內(nèi)側(cè)前腦束與黑質(zhì)注射6-羥多巴胺（6-OHDA）的方法制備PD大鼠模型。將大鼠隨機(jī)分為Sham組（生理鹽水代替6-OHDA）、PD對(duì)照組、NSCs移植組、OECs移植組、NSCs與OECs聯(lián)合移植組。移植1周后各組進(jìn)行阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果與PD對(duì)照組相比，聯(lián)合移植組旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中旋轉(zhuǎn)圈速更低（F=23.48，q=3.90，P<0.05），曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離更長(zhǎng)（F=4.59，q=4.16，P<0.05），曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間和周?chē)鷧^(qū)域活動(dòng)時(shí)間比值也更低（F=3.72，q=4.65，P<0.05）;NSCs和OECs單獨(dú)移植組上述指標(biāo)與PD對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論胚胎中腦組織來(lái)源的NSCs與OECs聯(lián)合移植可以改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)能力。

[關(guān)鍵詞]?帕金森病;神經(jīng)干細(xì)胞;嗅鞘細(xì)胞;細(xì)胞移植;大鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R338.2;R742.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號(hào)]??2096-5532（2019）01-0017-05

EFFECT OF COMBINED TRANSPLANTATION OF NEURAL STEM CELLS AND OLFACTORY ENSHEATHING CELLS ON MOTOR AND NON-MOTOR BEHAVIORS IN RATS WITH PARKINSONS DISEASE

ZHOU Nannan， WANG Youcui， HUANG Yuju， XIE Junxia

（Department of Physiology， State Key Disciplines： Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of combined transplantation of neural stem cells （NSCs） and olfactory ensheathing cells （OECs） on motor and non-motor behaviors in rats with Parkinsons disease （PD）.

MethodsNSCs were collec-ted from the mid-brain tissue of fetal rats aged 11-12 d and were then cultured and identified. OECs were collected from the olfactory bulbs of neonatal rats aged 1-3 d and were then cultured and identified. A rat model of PD was established by injection of 6-OHDA into the medial forebrain bundle and the substantia nigra. The rats were randomly divided into Sham group （6-OHDA was replaced by normal saline）， PD control group， NSCs transplantation group， OECs transplantation group， and NSCs-OECs combined with transplantation group. At one week after transplantation， the apomorphine-induced rotation test and the open field test were performed for each group.

ResultsCompared with the PD control group， the NSCs-OECs combined with transplantation group had a significantly lower rotational speed in the rotation test （F=23.48，q=3.90，P<0.05）， a significantly longer movement distance in the open field test （F=4.59，q=4.16，P<0.05）， and a significantly lower ratio of the activity time in the central area to the activity time in the surrounding area （F=3.72，q=4.65，P<0.05）. There were no significant differences in the above indices between the NSCs transplantation group/OECs transplantation group and the PD control group （P>0.05）.

ConclusionCombined transplantation of NSCs derived from the embryonic mid-brain tissue and OECs can improve the motor and non-motor beha-viors of PD rats.

[KEY WORDS]Parkinson disease; neural stem cells; olfactory ensheathing cells; cell transplantation; rats

帕金森病（PD）現(xiàn)已成為僅次于阿爾茲海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病[1]。近年來(lái)，我國(guó)PD病人數(shù)量隨著人口老齡化的加劇而急劇上升，但目前該病仍無(wú)有效治療方法。近30年來(lái)，干細(xì)胞研究所取得的成就為PD治療帶來(lái)了新的希望[2]。PD主要的病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元（DNs）的漸進(jìn)性丟失，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺（DA）消耗殆盡[3]。理論上，通過(guò)向受損區(qū)域補(bǔ)充DNs就有可能恢復(fù)或重建原有的功能。近年來(lái)，研究人員在使用神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植治療PD方面進(jìn)行了大量

的研究[4]。最近的研究結(jié)果表明，人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的NSCs移植到PD大鼠的紋狀體后能夠分化成具有功能的DNs[5]，而人孤雌干細(xì)胞來(lái)源的NSCs移植治療PD病人也具有良好的組織相容性和低致瘤性[6]。但受損的黑質(zhì)和紋狀體系統(tǒng)缺乏DNs存活和發(fā)育所需的微環(huán)境，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTFs）匱乏[7]，DNs變性死亡導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化并產(chǎn)生大量炎癥因子，導(dǎo)致NSCs存活率低，且不利于NSCs向DNs方向分化[8-9]。因此，優(yōu)化NSCs移植條件，為NSCs提供良好的局部微環(huán)境，具有非常重要的意義。嗅鞘細(xì)胞（OECs）是一種介于施旺細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的特殊類(lèi)型的膠質(zhì)細(xì)胞[10]，可分泌多種促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和存活的NTFs，還可分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[11]。有研究證實(shí)，OECs與胚胎中腦組織聯(lián)合移植8周后能明顯改善6-羥多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能[12]。然而，短時(shí)間內(nèi)NSCs與OECs聯(lián)合移植是否對(duì)PD大鼠的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)行為產(chǎn)生影響鮮有報(bào)道，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量為（250±10）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。孕鼠和出生1～3 d乳鼠由青島大任富城公司提供。將成年雄性大鼠隨機(jī)分為Sham組（A組）、PD對(duì)照組（B組）、NSCs移植組（C組）、OECs移植組（D組）和NSCs與OECs聯(lián)合移植組（簡(jiǎn)稱(chēng)聯(lián)合移植組，E組）。

1.2?藥物和試劑

鹽酸阿撲嗎啡（APO）、6-OHDA（Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone公司），青鏈霉素混合液（Solarbio公司），表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、胎牛血清和B-27supplement（Gibco公司），小鼠源Nestin單克隆抗體（Millipore公司），即用型山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司），兔源P75NTR單克隆抗體（Abcam公司），兔抗鼠IgG熒光二抗（Invitrogen公司），驢抗兔IgG熒光二抗（Life technologies公司），4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）細(xì)胞核染色液（碧云天公司）。

1.3?NSCs的培養(yǎng)與鑒定

取孕11～12 d大鼠胚胎中腦組織，剔除表面的腦膜，吹打均勻，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾離心后進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，用含體積分?jǐn)?shù)0.02 B-27supplement、10 g/L青鏈霉素混合液、20 μg/L EGF、10 μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。NSCs培養(yǎng)5～7 d時(shí)進(jìn)行傳代，傳至第3代時(shí)用于鑒定和移植。NSCs經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定10 min，即用型山羊血清封閉，加入小鼠源Nestin單克隆抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜;洗脫后加兔抗小鼠IgG熒光二抗（1∶500）室溫下孵育2 h，加入DAPI室溫下染色細(xì)胞核5 min后洗脫并封片拍照。

1.4?OECs的培養(yǎng)與鑒定

取出生1～3 d乳鼠嗅球，剔除表面的腦膜，吹打均勻，加入2.5 g/L胰酶37 ℃消化10～15 min，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾離心后進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，再用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、10 g/L 青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。采用Nash差速貼壁法[13]純化OECs。OECs培養(yǎng)4～5 d時(shí)進(jìn)行換液。將OECs接種于多聚賴(lài)氨酸包被的玻片上，4～5 d進(jìn)行全量換液。培養(yǎng)10 d左右的OECs用兔源P75NTR單克隆抗體（1∶50）行免疫鑒定（同NSCs）。

1.5?PD大鼠模型的制備

在右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束和黑質(zhì)兩點(diǎn)注射6-OHDA制備PD大鼠模型。參照以往的文獻(xiàn)[14]，采用大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位，并注射3.6 g/L的6-OHDA。注射藥液體積和坐標(biāo)如下：A點(diǎn)3 μL（前囟后-4.4 mm，旁開(kāi)-1.2 mm，深度-7.8 mm）;B點(diǎn)2.5 μL（前囟后-4.0 mm，旁開(kāi)-0.8 mm，深度-8.0 mm）[15]。Sham組則以等體積的生理鹽水代替。在6-OHDA造模手術(shù)后28 d，對(duì)大鼠進(jìn)行APO（0.1 mg/kg）頸部皮下注射，連續(xù)檢測(cè)30 min大鼠由損毀側(cè)向健康側(cè)旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)[16]，并計(jì)算旋轉(zhuǎn)速度，若旋轉(zhuǎn)速度>7 r/min，則證明PD模型構(gòu)建成功。

1.6?細(xì)胞移植

在6-OHDA造模手術(shù)后28 d，選擇PD模型大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植，移植坐標(biāo)為前囟后+0.5 mm、旁開(kāi)-2.0 mm、深度-5.0 mm。細(xì)胞移植各組在上述坐標(biāo)注入新鮮制備的細(xì)胞密度為2.5×1011/L的細(xì)胞懸液2 μL。PD對(duì)照組用2 μL的DMEM高糖培養(yǎng)液替代細(xì)胞懸液。聯(lián)合移植組NSCs與OECs的細(xì)胞數(shù)之比為1∶1。

1.7?旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞移植術(shù)后7 d，對(duì)大鼠進(jìn)行APO（0.1 mg/kg）頸部皮下注射，連續(xù)檢測(cè)30 min大鼠由損毀側(cè)向健康側(cè)旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)，并計(jì)算旋轉(zhuǎn)速度。

1.8?曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞移植術(shù)后7 d，將待測(cè)大鼠輕輕放置在曠場(chǎng)中心區(qū)域，通過(guò)視頻捕獲分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠自主活動(dòng)10 min。采用Ethvision XT軟件自動(dòng)獲取每只大鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離及在中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間（Pt）和周?chē)鷧^(qū)域活動(dòng)時(shí)間（Ct）[17]。以大鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離反映其運(yùn)動(dòng)行為能力;以Pt/Ct反映大鼠的焦慮程度，比值越高說(shuō)明焦慮程度越高，反之則越低[18]。

1.9?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS和GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA檢驗(yàn)），以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)??果

2.1?NSCs與OECs的鑒定

培養(yǎng)至第3代的NSCs的免疫熒光染色顯示，細(xì)胞球內(nèi)的NSCs呈Nestin陽(yáng)性，說(shuō)明培養(yǎng)后細(xì)胞球能保持NSCs的增殖特性。OECs的免疫熒光染色顯示，生物標(biāo)記物P75NTR呈陽(yáng)性，說(shuō)明貼壁的絕大多數(shù)細(xì)胞為OECs。

2.2?行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，其余4組大鼠的旋轉(zhuǎn)速度均明顯增加（F=23.48，q=6.81～12.81，P<0.01）;與PD組相比，聯(lián)合移植組的旋轉(zhuǎn)速度明顯降低（q=3.90，P<0.05）。見(jiàn)表1。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，PD對(duì)照組和OECs移植組的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離較短（F=4.59，q=5.03、4.20，P<0.05）;與PD對(duì)照組相比，NSCs移植組和OECs移植組的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而聯(lián)合移植組的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離明顯增加（q=4.16，P<0.05）;聯(lián)合移植組的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離與兩個(gè)單獨(dú)移植組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PD對(duì)照組的Pt/Ct較Sham組明顯增高（F=3.72，q=4.75，P<0.05），OECs移植組和聯(lián)合移植組的Pt/Ct較PD對(duì)照組明顯降低（q=4.73、4.65，P<0.05）。見(jiàn)表1。

3?討??論

當(dāng)改善病人的運(yùn)動(dòng)功能，這拉開(kāi)了細(xì)胞替代治療PD的序幕。但目前也有研究顯示，NSCs移植治療PD還存在很多問(wèn)題，如細(xì)胞存活率低[20]，這與移植宿主的局部微環(huán)境息息相關(guān)[21]，而受損的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)顯然不利于NSCs的存活、增殖與分化[22]。研究表明，OECs能分泌大量的NTFs和細(xì)胞因子，可改善局部微環(huán)境，促進(jìn)NSCs向DNs方向分化，并為殘存的神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持[23]。這為NSCs分化為更多的DNs以替代退行性病變丟失的神經(jīng)元和恢復(fù)神經(jīng)功能奠定了基礎(chǔ)。

JOHANSSON等[12]將胚胎VM與OECs聯(lián)合移植入PD大鼠，2、3、7、8周后，與對(duì)照組相比，單獨(dú)VM或OECs移植組與二者聯(lián)合移植組的運(yùn)動(dòng)功能均有明顯改善，但與單獨(dú)OECs或VM移植組相比較，聯(lián)合移植組的改善效果更好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩個(gè)單獨(dú)移植組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，NSCs與OECs聯(lián)合移植1周后，PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯改善，與PD對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;聯(lián)合移植組與單獨(dú)移植組相比以及單獨(dú)移植組與PD對(duì)照組相比較雖有改善，但差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)聯(lián)合移植組之所以能夠改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，可能是由于OECs分泌的NTFs和各種細(xì)胞因子改善了NSCs所處的局部微環(huán)境，提高了移植后NSCs存活率和分化成DNs的能力;而單獨(dú)移植后的NSCs存活率較低，NSCs分化成DNs的數(shù)量較少，且OECs分泌各種營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用與促進(jìn)神經(jīng)元的成熟均需要時(shí)間，致使NSCs與OECs單獨(dú)移植1周不能顯著改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。另有研究表明，單獨(dú)OECs移植24周后PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能沒(méi)有改善，這也許是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，OECs的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸喪失;但OECs與NSCs聯(lián)合移植確實(shí)比NSCs單獨(dú)移植更能改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]，這可能是由于OECs保護(hù)更多的NSCs存活下來(lái)，并促進(jìn)其分化成具有功能的DNs，

故而產(chǎn)生更好且穩(wěn)定地促進(jìn)PD大鼠運(yùn)動(dòng)功能改善的作用。由此可見(jiàn)，OECs體內(nèi)移植時(shí)，其神經(jīng)保護(hù)功能在初期發(fā)揮巨大作用，但保持穩(wěn)定而持久的改善作用還需NSCs分化的DNs替代退行性病變丟失的神經(jīng)元，故OECs與NSCs聯(lián)合移植治療PD是一種具有很大開(kāi)發(fā)潛力的方法。

既往研究多關(guān)注NSCs移植促進(jìn)PD模型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的改善，而鮮少關(guān)注對(duì)非運(yùn)動(dòng)癥狀的影響。本研究結(jié)果表明，OECs與NSCs聯(lián)合移植1周后，PD大鼠的非運(yùn)動(dòng)癥狀明顯改善，即二者聯(lián)合移植可以緩解PD大鼠的焦慮癥狀;單獨(dú)移植OECs也可顯著降低PD大鼠的焦慮程度。推測(cè)OECs移植組或聯(lián)合移植組之所以能夠在短時(shí)間內(nèi)改善PD大鼠的焦慮程度，可能均得益于OECs的神經(jīng)保護(hù)作用，故單獨(dú)移植NSCs組沒(méi)有明顯的改善效果。

馮蕾等[25]的研究結(jié)果表明，將OECs條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)6-OHDA損傷的PC12細(xì)胞，可顯著提高PC12細(xì)胞BCL2/Bax的表達(dá)比率，從而降低6-OHDA對(duì)PC12的損傷。體內(nèi)研究顯示，OECs與NSCs聯(lián)合移植治療創(chuàng)傷性腦外傷模型大鼠時(shí)可抑制炎癥因子腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的表達(dá)，從而促進(jìn)TBI大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[26]。然而目前OECs與NSCs聯(lián)合移植促進(jìn)PD動(dòng)物模型運(yùn)動(dòng)功能改善的作用機(jī)制還不清楚，需進(jìn)一步探究。

綜上所述，NSCs和OECs兩種細(xì)胞聯(lián)合移植能夠在短期內(nèi)改善PD大鼠的運(yùn)動(dòng)功能與焦慮癥狀，為細(xì)胞治療PD提供了新的實(shí)驗(yàn)支持，但相關(guān)機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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