薛小蘭 陳少美

摘 要：研究灰樹花多糖的最佳提取工藝條件，采用單因素試驗研究pH值、提取時間、料液比、提取溫度4個因素對灰樹花多糖提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)置四因素三水平正交試驗，以灰樹花多糖提取率為指標(biāo)，優(yōu)化最佳提取工藝。結(jié)果表明：各試驗因素影響主次順序為提取時間>pH值>料液比>提取溫度；灰樹花多糖的最佳提取工藝條件為：pH值7.5，提取時間 2.0 h，料液比1∶20，提取溫度為90℃，采用此工藝條件提取灰樹花多糖提取率為20.94%。

關(guān)鍵詞：灰樹花；多糖；提取工藝；正交試驗

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.01.009

Abstract： The optimal extraction conditions of Grifola frondosa were studied. The effects of pH value， extraction time， solidliquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from Grifola frondosa were studied by single factor test. On the basis of single factor test， four factors and three levels orthogonal experiments were set up to optimize the extraction process with the extraction rate of Grifola frondosa polysaccharides as the index. The results showed that the order of influencing factors was extraction time>pH value>solidliquid ratio>extraction temperature. The optimum extraction condictions were pH 7.5， extraction time 2.0 h， solidliquid ratio 1∶20，and extraction temperature 90℃. With these conditions， the extraction rate was 20.94%.

Key words： Grifola frondosa； polysaccharides； extraction technology； orthogonal experiment

灰樹花是一種食藥兩用菌[1]?；覙浠I養(yǎng)豐富，多種營養(yǎng)物質(zhì)居各種食用菌之首，經(jīng)檢測灰樹花蛋白質(zhì)含量25.2 g·hg-1，并含有多種有益的礦物質(zhì)（如：鈣、鐵、銅、鉀、磷等）以及豐富的維生素（其中Ve、Vc的含量是其他食用菌類的10～20倍）。所以常食灰樹花可以提高機體的免疫力，增強體質(zhì)?；覙浠ㄟ€含有多種有效藥用成分，其中多糖是灰樹花中最主要的一類活性成分，大量的研究表明多糖具有抗腫瘤、抗HIV、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖、降血壓、抗氧化等藥理活性[2]。因此，建立高效、經(jīng)濟的灰樹花多糖提取工藝具有重要的意義。本研究以灰樹花子實體為試驗對象，采用熱水浸提，然后醇沉得到灰樹花多糖，并通過單因素試驗和正交試驗，獲得灰樹花多糖提取的最佳工藝條件，為大規(guī)模的市場生產(chǎn)提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灰樹花子實體：樣品烘干粉粹，過80目篩備用。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要試劑 無水乙醇、濃硫酸、葡萄糖、苯酚溶液均為分析純級化學(xué)試劑。

1.2.2 試驗儀器設(shè)備 數(shù)顯三用水浴鍋HH3A（金壇市精達儀器制造廠）；電子分析天平HZ7（美國康州HZ電子科技責(zé)任有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵SHZDIII（鞏義市予華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE501系列（上海予華儀器設(shè)備）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DZF6250（上海秣馬恒溫設(shè)備廠）；紫外可見分光光度計（蘇州奇樂電子科技儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 灰樹花多糖提取工藝流程 灰樹花經(jīng)除雜、干燥、粉碎等預(yù)處理后，得到灰樹花實體干粉。準(zhǔn)確稱取灰樹花干粉若干份，每份5 g。將灰樹花干粉用熱水浸提，抽濾得到濾液，將濾液濃縮得到膏狀的提取物，加入大約3倍于提取物體積的無水乙醇，冷藏過夜，收集沉淀物，去除乙醇得到灰樹花粗多糖[3]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于具塞試管中，并加入蒸餾水至總體積1 mL，空白管為1 mL的蒸餾水，每個試管按順序依次加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min，30℃水浴中顯色30 min，設(shè)定波長490 nm，測其吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x）[4]。

1.3.3 測定灰樹花多糖含量 根據(jù)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值，利用回歸方程計算灰樹花多糖的含量。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計 單因素試驗主要考察pH值（6.5、7.0、7.5、8.0）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取溫度（70℃、80℃、90℃、100℃）對灰樹花多糖提取率的影響。每組試驗稱取4份灰樹花干粉5 g進行灰樹花多糖的提取，測定灰樹花多糖含量，根據(jù)如下公式計算出灰樹花多糖的提取率。

提取率（%）=多糖含量/5 g×100

1.3.5 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH值、提取時間、料液比、提取溫度4個因素[5]，以灰樹花多糖提取率為考核指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對灰樹花粗多糖提取工藝進行優(yōu)化，以得到灰樹花多糖的最佳提取條件。試驗各因素和水平設(shè)計見表1。

1.3.6 工藝驗證試驗 根據(jù)正交試驗結(jié)果篩選出的最佳提取工藝條件進行驗證試驗，3次平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0139x-0.0126， 線性相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9958。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 pH對多糖提取率的影響 由試驗結(jié)果可知，pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0時，灰樹花多糖提取率分別為17.22%、20.68%、17.67%、19.00%。表明灰樹花多糖提取率隨著pH的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH值為7的條件下提取率最高。

2.2.2 料液比對多糖提取率的影響 由試驗結(jié)果可知，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）時，灰樹花多糖提取率分別為12.46%、15.98%、20.56%、16.78%。表明料液比在（1∶20）～（1∶40）范圍內(nèi)，隨著料液比的增加灰樹花多糖的提取率顯著增多，當(dāng)繼續(xù)增加料液比灰樹花多糖提取率反而有所下降，從成本和效益上考慮，選擇料液比1∶30為最佳。

2.2.3 提取時間對多糖提取率的影響 由試驗結(jié)果可知，提取時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5 h時，灰樹花多糖提取率分別為2.50%、12.82%、6.60%、5.80%。表明提取時間在1.0～1.5 h范圍內(nèi)，灰樹花多糖提取率明顯增加，當(dāng)繼續(xù)增加提取時間灰樹花多糖提取率開始下降。這說明灰樹花多糖提取過程受時間影響比較大，時間太短，灰樹花多糖溶出不夠充分，但時間過長，多糖的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化使得率降低。因此最佳提取時間為1.5 h。

2.2.4 提取溫度對多糖提取率的影響 由試驗結(jié)果可知，提取溫度分別為70℃、80℃、90℃、100℃時，灰樹花多糖提取率分別為18.21%、20.52%、19.55%、17.77%。表明在提取溫度70～80℃的范圍內(nèi)，灰樹花多糖提取率呈升高趨勢，但溫度升高多糖得率反而下降。因此，80℃為最佳的提取溫度。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表2可知，各因素對灰樹花多糖提取率的影響依次為B>A>C>D，灰樹花多糖的提取最佳條件為A2B2C1D3，即pH值7.5，提取時間2 h，料液比1∶20，提取溫度90℃。在此最佳工藝條件下，灰樹花多糖的提取率為20.76%，優(yōu)于正交試驗表中其他組合項，表明該最佳工藝條件可行，可以作為灰樹花多糖的水提工藝條件。

2.4 驗證試驗結(jié)果

為了驗證正交試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取pH值7.5，提取時間為2.0 h，料液比為1∶20，提取溫度為90℃，進行試驗，平行3次，計算得到灰樹花多糖的得率分別為20.92%、20.73%、21.19%，3次平均值為20.94%，通過驗證試驗表明，該工藝可靠穩(wěn)定，具有簡單、易行、可靠的特點，可以為灰樹花多糖的進一步開發(fā)利用提供參考。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗對灰樹花多糖提取工藝進行優(yōu)化，試驗結(jié)果表明：各個因素對灰樹花多糖提取率的影響順序為提取時間>pH值>料液比>提取溫度；灰樹花多糖最佳提取工藝條件為pH值7.5，提取時間2.0 h，料液比1∶20，提取溫度90℃。

參考文獻：

[1]劉炳福，宮志遠，張華，等.灰樹花多糖提取工藝的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（3）：104-106.

[2]邊杉，葉波平，奚濤，等.灰樹花多糖的研究進展[J].藥物生物技術(shù)，2004，11（1）：60-63.

[3]汪維云，王繼先.灰樹花液體發(fā)酵及多糖提取工藝的優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報， 2007，23（4）：276-279.

[4]宮江寧，高川.正交試驗法優(yōu)化梔子多糖的提取工藝[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報，2017，35（3）：103-106.

[5]徐先祥，周麗，馬燕，等.正交實驗優(yōu)選赤芍提取工藝研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008（27）：41-42.

（責(zé)任編輯：柯文輝）