王紅梅

摘要：以苜蓿5～7 d苗齡無(wú)菌苗的子葉和下胚軸為外植體，研究培養(yǎng)基中不同激素和濃度配比對(duì)苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響。結(jié)果表明，MS+2，4-D 2.0 mg/L +6-BA 1.0 mg/L愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，且愈傷組織狀態(tài)良好，增殖速度快。MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L為苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為37.8%。胚性愈傷組織分化成苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 0.02 mg/L +蔗糖10.0 g/L。

關(guān)鍵詞：苜蓿;胚性愈傷組織;誘導(dǎo);植株再生

中圖分類(lèi)號(hào)：S551.7 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2019）10-0024-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.07.006

Key words：Medicago sativa Linn;Embryogenic callus;Induction;Plant regeneration

苜蓿（Medicago sativa Linn）為豆科苜蓿屬多年生宿根草本植物。苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)占其干重的15%～22%，適口性好，易于消化吸收，是世界上公認(rèn)的綠色優(yōu)質(zhì)牧草，被譽(yù)為“牧草之王”[1 ]。同時(shí)苜蓿具有抗寒抗旱、耐瘠薄、防風(fēng)固沙及改善土壤養(yǎng)分等特點(diǎn)[2 - 4 ]，大面積種植優(yōu)質(zhì)苜蓿，對(duì)促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展和西部生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建具有重要意義。但苜蓿屬于典型的異花受粉植物，自交結(jié)實(shí)率極低，通常為1%～3%，通過(guò)常規(guī)雜交育種方法進(jìn)行品質(zhì)改良難以實(shí)現(xiàn)[5 - 6 ]。借助于植物組織培養(yǎng)和現(xiàn)代生物技術(shù)，不僅可以克服苜蓿種子產(chǎn)量低的困難，而且能夠?qū)?yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲(chóng)害、耐鹽堿等相關(guān)基因?qū)胲俎?，培育適合在不同生態(tài)環(huán)境下種植的品種[7 - 8 ]，加快育種進(jìn)程，豐富苜蓿種質(zhì)資源。

目前，通過(guò)轉(zhuǎn)基因改良植物遺傳特性的技術(shù)已滲透到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的方方面面。我國(guó)關(guān)于苜蓿轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道較多，有通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良抗寒[9 ]、耐鹽堿[10 ]，以至作為生物反應(yīng)器表達(dá)免疫蛋白等的研究[11 ]，但普遍存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)困難、植株分化率低、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題[12 ]，嚴(yán)重制約轉(zhuǎn)基因技術(shù)在苜蓿遺傳改良中的應(yīng)用。誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織的形成和組織、器官的形態(tài)建成是實(shí)現(xiàn)苜蓿細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們以苜蓿子葉和下胚軸為外植體，通過(guò)探索和優(yōu)化培養(yǎng)基成分和植物外源激素的種類(lèi)和配比來(lái)誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成，由胚性愈傷組織進(jìn)而分化形成新的植株，建立苜蓿高頻再生體系，以期為進(jìn)一步開(kāi)展苜蓿細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供支持。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

指示苜蓿品種為甘農(nóng)1號(hào)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院曹致中教授提供，為適宜在我國(guó)西北部、甘南草原、青藏高原邊緣種植的抗寒、抗旱優(yōu)良品種。

1.2 ? 方法

1.2.1 ? ?種子消毒處理 ? ?選取飽滿的苜蓿種子，在流水下沖洗30 min，75%酒精消毒45 s，0.1%升汞振蕩消毒8 min，無(wú)菌水漂洗4次（每次2 min），用無(wú)菌濾紙吸干，接種到MS培養(yǎng)基上，于（23±2） ℃條件下暗培養(yǎng)。待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.2 ? ?外植體的建立 ? ?取5～7 d苗齡的無(wú)菌實(shí)生苗子葉和下胚軸，將子葉沿葉脈方向切成兩半，下胚軸切成0.5 cm左右的切斷，分別接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每處理接種子葉和下胚軸各20個(gè)，3次重復(fù)。外植體暗培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)16 h光照、8 h黑暗，光強(qiáng)度為2 500 lx，溫度（23±2） ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.3 ? ?培養(yǎng)基 ? ?誘導(dǎo)培養(yǎng)基3種，Ⅰ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L;Ⅱ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT1.0 mg/L;Ⅲ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L +6-BA 1.0 mg/L。胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.05～ 0.20 mg/L。分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 0.01～0.05 mg/L。生根培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 0～0.03 mg/L +蔗糖7.5～15.0 g/L。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同激素及其配比對(duì)苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，不同的植物外源激素和濃度配比對(duì)苜蓿外植體愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織狀態(tài)有較大影響（表1）。

從觀察結(jié)果看出，3種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織，但誘導(dǎo)率差異明顯，狀態(tài)各不相同。從外植體細(xì)胞開(kāi)始分裂的時(shí)間來(lái)看，Ⅲ型培養(yǎng)基啟動(dòng)細(xì)胞分裂的時(shí)間最短，僅為2～3 d;其次是Ⅰ型培養(yǎng)基;Ⅱ型培養(yǎng)基細(xì)胞啟動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)，為8～10 d。3種培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率差異明顯，由高到低依次為Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。從愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，Ⅰ型培養(yǎng)基、Ⅱ型培養(yǎng)基誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生的質(zhì)地緊密，生長(zhǎng)緩慢，由下胚軸形成的愈傷組織呈白色粉末或無(wú)色水漬狀，生長(zhǎng)快但易于褐化;外植體在Ⅲ型培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d時(shí)，子葉形成的愈傷組織呈新鮮的黃綠色，表面有顆粒狀突起，下胚軸愈傷組織呈淺黃綠色塊狀，質(zhì)地疏松，增殖快（圖1，圖2）。綜合來(lái)看，2，4-D與6-BA配合使用，比單一使用2，4-D效果更好。在Ⅱ型培養(yǎng)基中，因加入了激動(dòng)素KT，反而抑制了愈傷組織的誘導(dǎo)，說(shuō)明了KT不利于啟動(dòng)苜蓿細(xì)胞的分裂。可見(jiàn)，甘農(nóng)1號(hào)子葉和下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)以2，4-D與6-BA配合使用效果較好， MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L是愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。

2.2 ? 激素對(duì)苜蓿胚性愈傷組織形成的影響

由子葉和下胚軸形成的愈傷組織繼代培養(yǎng)2～3次后，轉(zhuǎn)接到添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d時(shí)，部分愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭w粒狀的胚性愈傷組織，不同激素配比下胚性愈傷組織形成效果差異明顯（表2）。

觀察發(fā)現(xiàn)，6-BA與低濃度NAA配合使用可促使苜蓿愈傷組織轉(zhuǎn)變成為胚性愈傷組織，且子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高于下胚軸。在6-BA濃度為0.5 mg/L的條件下，低濃度的NAA更有利于體細(xì)胞胚的形成，此時(shí)的愈傷組織表面有顆粒狀突起，結(jié)構(gòu)疏松分散性好，呈淡黃綠色有光澤（圖3 ）。當(dāng)NAA濃度由0.05 mg/L增加到0.20 mg/L時(shí)，子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)率由37.8%降低到8.9%，可見(jiàn)在6-BA存在的前提下，NAA的濃度對(duì)胚性愈傷組織形成起決定性作用。在相同培養(yǎng)條件下，下胚軸愈傷組織增殖速度較快，呈淺綠色塊狀（圖4），但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高僅為6.7%。

2.3 ? 苜蓿胚性愈傷組織分化成苗

苜蓿胚性愈傷組織形成后，在MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L的6-BA的條件下，配合使用0.01～0.05 mg/L的NAA，在16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)10～20 d則有助于植株形態(tài)的建成（圖5），其中胚性愈傷組織接種在培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L上時(shí)分化成苗率可達(dá)75.2%。

2.4 ? 再生植株生根培養(yǎng)

將再生植株轉(zhuǎn)接到蔗糖用量分別為7.5、10.0、15.0 g/L的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d后陸續(xù)有乳白色根生成，且隨著蔗糖用量的提高生根所需時(shí)間延長(zhǎng)。在3種培養(yǎng)基中，以蔗糖用量為10.0 g/L的1/2MS生根時(shí)間較短，根的狀態(tài)較好，有2～3個(gè)分叉。當(dāng)蔗糖用量提高到15.0 g/L時(shí)，生根時(shí)間延長(zhǎng)7 d左右，且生成的根細(xì)長(zhǎng)，側(cè)根少，可見(jiàn)高濃度蔗糖對(duì)苜蓿生根有抑制作用。將培養(yǎng)基調(diào)整為1/2MS+ NAA 0.02 mg/L +蔗糖10.0 g/L時(shí)，再生植株生根時(shí)間縮短，10～15 d內(nèi)生根，根數(shù)量多，狀態(tài)好（圖6），有利于提高移栽成活率。

3 ? 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中可利用的外植體類(lèi)型很多，如葉片、葉柄、花瓣、花藥、種子、塊莖、鱗片、根尖等。以種子為培養(yǎng)材料的，大多數(shù)是將種子消毒后接種子培養(yǎng)基上，萌發(fā)后取無(wú)菌實(shí)生苗的子葉、下胚軸或根尖為外植體。本研究取苜蓿子葉和下胚軸為材料，從結(jié)果可以看出，愈傷組織誘導(dǎo)和分化在二者之間都有差異。單從愈傷組織誘導(dǎo)率來(lái)講，下胚軸誘導(dǎo)率大于子葉;但從愈傷組織狀態(tài)來(lái)看，子葉愈傷組織呈新鮮的黃綠色，表面有顆粒狀突起，分化成苗的幾率比較大，而下胚軸愈傷組織呈白色雪花狀或淺綠色塊狀，分散性好，生長(zhǎng)旺盛，分化成苗難度大，可作為苜蓿細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的首選材料。

激素種類(lèi)及配比對(duì)植物愈傷組織的誘導(dǎo)和芽、根等器官的形成起著重要的調(diào)節(jié)作 用[13 ]。在本研究中，單獨(dú)使用2，4-D，或2，4-D與6-BA、KT配合使用，均能不同程度地誘導(dǎo)苜蓿外植體產(chǎn)生愈傷組織，但以2，4-D與6-BA質(zhì)量配比為2∶1時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)100%，愈傷組織狀態(tài)較好，這與伊風(fēng)艷 ? ?等[14 ] 、秦楚等[12 ]關(guān)于苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)研究的結(jié)果一致。李聰?shù)萚15 ]認(rèn)為KT在苜蓿誘導(dǎo)分化過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，但本研究發(fā)現(xiàn)，添加了KT培養(yǎng)基的甘農(nóng)1號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)率下降。因此，使用一種或幾種培養(yǎng)基并不適合所有苜蓿品種愈傷誘導(dǎo)和再分化，針對(duì)不同基因型選擇愈傷組織誘導(dǎo)和再生的激素種類(lèi)和濃度是必要的。

對(duì)植物器官、組織、細(xì)胞離體培養(yǎng)所產(chǎn)生的愈傷組織，在一定條件下可進(jìn)一步誘導(dǎo)器官再生或胚狀體而形成植株。本研究結(jié)果表明，影響苜蓿愈傷組織繼代培養(yǎng)的主要因素是激素，如果保持較高的生長(zhǎng)素（2，4-D 2.0 mg/L）和細(xì)胞分裂素（6-BA 1.0 mg/L）濃度，則愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，增殖速度快，但隨著繼代次數(shù)的增多，其分化成苗的能力下降。在去除2，4-D、降低6-BA濃度（0.5 mg/L）的條件下，在培養(yǎng)基中添加NAA 0.05～0.10 mg/L有利于苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高為37.8%。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是解決苜蓿外植體再生頻率低的有效途徑。同時(shí)，胚性愈傷組織呈淺黃色松散顆粒狀結(jié)構(gòu)，活性好，增殖速度快，可作為苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想受體材料，降低嵌合體的形成，大幅度提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。

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（本文責(zé)編：楊 ? ?杰）