呂曉梅 鄒天才 汪建文 洪江 劉海燕 郭米香

摘?要：該研究采用浸提法和GC-MS檢測了貴州石筆木種子內(nèi)源有機(jī)化合物種類、相對含量，以及種皮和胚乳在不同溶劑、溫度和濃度條件下的浸提物活性。結(jié)果表明：（1）種皮和胚乳中皆含有有機(jī)酸、烯、酯、醇、醛、酚6類相對含量較高的有機(jī)化合物，其中種皮含有機(jī)酸7種、烯類1種、酯類5種、醇類3種、醛類3種、酚類1種，胚乳含有機(jī)酸6種、烯類1種、酯類1種、醇類1種、醛類1種、酚類1種。（2）種皮浸提物活性顯著高于胚乳浸提物活性（P<0.05），且其烯、醛、醇和酯類含量分別高出胚乳含量的8.78%、2.66%、2.15%和1.70%，可能是對種子萌發(fā)起主要作用的內(nèi)源抑制物質(zhì)。（3）不同條件下處理的浸提液均能顯著抑制白菜種子發(fā)芽及幼苗生長，浸提液抑制物活性表現(xiàn)為醇溶劑大于水溶劑，并隨著浸提液濃度的升高而增大、隨著浸提溫度的升高而增強(qiáng)，在初始溫度為100 ℃時(shí)，浸提液抑制活性達(dá)到最大值。貴州石筆木種子的內(nèi)源有機(jī)化合物在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮著不同程度的抑制作用，探索其與種子萌發(fā)的作用機(jī)制，解決種子萌發(fā)育苗的關(guān)鍵技術(shù)及在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，這在植物種子的生物學(xué)特性及萌發(fā)生理研究方面具有重要意義。

關(guān)鍵詞：種子活力， 種子內(nèi)源抑制物， GC-MS鑒定， 萌發(fā)生理， 貴州石筆木

中圖分類號：Q946， Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1558-10

Abstract：The components and contents of endogenous inhibitors in seed germination of Tutcheria kweichowensis were identified by extraction method and GC-MS， as well as the activity of extracts from seed coat and endosperm in different solvents， temperatures and concentrations. The results were as follows：（1） The seed coat and endosperm contained six kinds of organic compounds， such as organic acids， olefins， esters， alcohols， aldehydes， phenols and so on. The seed coat contained 7 organic acids， 1 alkene， 5 esters， 3 alcohols， 3 aldehydes and 1 phenol. The endosperm contained 6 organic acids， 1 alkene， 1 ester， 1 alcohol， 1 aldehyde and 1 phenol.（2） The activity of extracts from seed coat was significantly higher than that of endosperm extract（P<0.05）， and the contents of olefins， aldehydes， alcohols and esters were 8.78%， 2.66%， 2.15% and 1.70% higher than that of endosperm.（3） The extracts from different conditions could significantly inhibit the germination and seedling growth of Brassica pekinensis. The activity of extract inhibitors was higher in alcohol than in water， and increased with the increase of extract concentration and temperature. When the initial temperature was 100 ℃， the inhibitory activity of the extract reached the maximum. The endogenous inhibitors of Tutcheria kweichowensis have different inhibitory effects on seed germination， exploring its mechanism of seed germination， solving the key technology of seed germination and seedling and application in agricultural and forestry production， which is of great significance in the research of biological characteristics and germination physiology of plant seeds.

Key words：seed vitality， endogenous inhibitors of seeds， GC-MS identification， germination physiology， Tutcheria kweichowensis

種子的發(fā)育、內(nèi)源物質(zhì)積累及休眠調(diào)控研究，既是深入理解植物生殖發(fā)育相關(guān)的重要基礎(chǔ)科學(xué)問題，也可為提高經(jīng)濟(jì)植物的產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供科學(xué)依據(jù)（劉春明等，2016）。種子休眠的原因一般包括胚未成熟、種皮構(gòu)造特殊和含有內(nèi)源抑制物質(zhì)三個方面（中山包，1988;卡恩，1989）。前人通過對種子內(nèi)源抑制物的研究，為解決種子休眠機(jī)理及其破眠技術(shù)問題提供了參考，四川牡丹種子休眠的根本原因來自于其內(nèi)源抑制物的作用（宋會興等，2012），野鴉椿種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的存在是其種子深度休眠的主要原因（廖源林等，2016），以及通過研究不同方法處理南方紅豆杉種子內(nèi)源抑制物的活性找到了破除休眠的方法（年慧慧等，2012），等等。植物種子內(nèi)的有機(jī)酸、酚類及酯類化合物是影響種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物質(zhì)（陳敏等，2017;景新明等，1999;趙敏，2003;孫佳等，2012;劉超等，2013），抑制物質(zhì)在種子中的存在部位不同，抑制作用及其解除方法也不同（胡俊杰等，2016;劉路璐，2016;劉序等，2018），因此，探索植物種子內(nèi)源抑制物質(zhì)及其活性與作用機(jī)制，解決好休眠種子育苗關(guān)鍵技術(shù)，這將在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。

貴州石筆木（Tutcheria kweichowensis）為山茶科石筆木屬分布最北的物種（28° N），常綠喬木、樹形美觀、材質(zhì)優(yōu)良、貴州特有（張宏達(dá)和任善湘，1988），其果實(shí)富含蛋白質(zhì)、脂肪、茶多酚、VE、Vc等，頗具經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。但是，由于其自然繁殖率低、分布區(qū)狹窄、局部種群普遍，在野生狀態(tài)下，種子萌發(fā)困難，林下更新幼苗少見，已成為具有Meta-種群生態(tài)特征的珍稀瀕危植物（鄒天才，2001）。目前，對貴州石筆木的研究主要集中在植物資源調(diào)查及其物種保護(hù)與利用評價(jià)等方面（呂曉梅等，2017;劉海燕，2007），而對貴州石筆木種子內(nèi)源有機(jī)化合物檢測及其對種子萌發(fā)作用研究卻少有報(bào)道。本文測試分析了貴州石筆木種子內(nèi)源有機(jī)化合物種類、相對含量及其活性作用，探討了其在不同種子部位、溶劑、溫度和濃度條件下的浸提液對種子萌發(fā)的影響，可為解決貴州石筆木的種子儲藏與播種育苗問題及其生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1?材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)種子采自貴州省赤水市葫市鎮(zhèn)金合村的野豬坪林區(qū)，采種的樹高為30～40 m，樹齡為10～20 a，隨機(jī)設(shè)5個樣方，每樣地采集種子5 kg，先在通風(fēng)干燥處自然晾干后，再將種子、種皮、胚乳（含胚）碾成粉末放入4 ℃冰箱備用。供試大白菜（Brassica pekinensis） 種子購買于貴陽市花溪區(qū)種子銷售公司。

1.2 方法

1.2.1 不同處理種子的浸提液對白菜種子萌發(fā)的影響?以蒸餾水浸種作對照，采用3種處理方式提取浸提液開展試驗(yàn)：（1）分別使用蒸餾水、80%甲醇作溶劑，浸提貴州石筆木種子、種皮、胚乳的粉末;（2）初始溫度分別為70、80、90、100 ℃的蒸餾水浸提貴州石筆木種子粉末（葉常豐，1994）;（3）分別量取25、50、75、100 mL初始溫度為100 ℃種子粉末的浸提液，蒸餾水定容至100 mL，設(shè)置濃度梯度為25%、50%、75%、100%的實(shí)驗(yàn)組份。分別稱量5 g待浸提物置于100 mL錐形瓶中，加入100 mL溶劑，保鮮膜封口，4 ℃條件下密閉浸提，間歇震蕩使其充分浸提，48 h后取出，布氏漏斗抽濾獲取浸提液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測統(tǒng)計(jì)經(jīng)浸提液浸泡的白菜種子萌發(fā)率（%）、根長（cm）和苗高（cm）。重復(fù)3次。

1.2.2 種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的提取分離?取種皮、胚乳粉末各10 g置于錐形瓶中，加入80%甲醇溶液使種子粉末完全浸沒，4 ℃條件下密閉浸提，間歇震蕩使其充分浸提，每隔24 h將浸提液用布氏漏斗抽濾，收集濾液后再重新加入80%甲醇溶液浸提，反復(fù)多次，浸提至浸提液顏色與浸提劑相似為止，再將所有濾液混合。采用系統(tǒng)溶劑分離法對種皮、胚乳的甲醇浸提液進(jìn)行分離（黃耀閣，1994）。首先將依次得到的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA上進(jìn)行減壓濃縮蒸發(fā)得到干物質(zhì)，然后用相應(yīng)有機(jī)溶劑定容為2 mL，置于4 ℃冰箱中保存。使用的儀器系美國安捷倫公司聯(lián)用儀（HP6890/5975C GC/MS），用微量注射器注入1 μL樣品溶液，放入毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分析（ZB-INOWAX，30 m × 0.25 μm × 0.25 mm）。先初始溫度45 ℃，保持2 min，再以5 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持16 min，運(yùn)行時(shí)間55 min，汽化室溫度250 ℃，載氣為高純He（99.999%），柱前壓7.64 psi，載氣流量1.0 mL·min-1，不分流，溶劑延遲時(shí)間5.0 min，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 612 V，接口溫度280 ℃，質(zhì)量控制范圍29～500 amu。

1.2.3 種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的鑒定?總離子流圖及其各峰數(shù)據(jù)，采用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)系統(tǒng)檢索分析，經(jīng)核對Nist2005和Wiley275的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜樣圖，確定揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)。用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以種皮和胚乳各分離相的離子流程圖的全部峰面積總和設(shè)為100%，每個峰面積與總面積之比值則代表了該成分在提取物中的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件多因素方差模型（陳勝可，2013）和Excel軟件圖表方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較（孫曉剛等，2016）。

2?結(jié)果與分析

2.1 不同種子部位、溶劑、濃度、溫度浸提液對白菜種子萌發(fā)的影響

表1結(jié)果顯示，白菜種子發(fā)芽率、根長和苗高都小于對照，抑制大小為種皮甲醇溶液>種子甲醇溶液>種皮水溶液>種子水溶液>胚乳甲醇溶液>胚乳水溶液，差異顯著（P<0.05）。浸提溶劑相同時(shí)，種皮浸提液處理顯著小于胚乳浸提液的處理，說明種皮中的內(nèi)源抑制物含量或活性高于胚乳。采用甲醇溶劑和水溶劑浸提貴州石筆木種子，其浸提液處理的白菜種子發(fā)芽率、根長、苗高全部小于對照，差異顯著（P<0.05）。浸提的種子部位相同時(shí)，甲醇溶劑浸提液處理顯著小于水溶劑浸提液處理，表明貴州石筆木種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的醇溶性大于水溶性。不同濃度貴州石筆木種子浸提液處理的發(fā)芽率、根長、苗高全部小于對照，差異顯著（P<0.05）。發(fā)芽率、根長、苗高隨浸提液濃度的升高而減小，濃度臨近100%時(shí)，抑制作用趨于最強(qiáng)。不同初始溫度處理的貴州石筆木種子浸提液浸種白菜種子的發(fā)芽率、根長、苗高都小于對照，差異顯著（P<0.05）;萌芽率、根長和苗高隨著浸提液初始溫度的升高而降低，初始溫度為100 ℃的浸提液處理白菜種子生長勢最差。

2.2 貴州石筆木種子有機(jī)相提取物質(zhì)的種類及含量

2.2.1 種皮和胚乳的石油醚相的提取物質(zhì)?將離子流程圖中峰面積明顯的有機(jī)化合物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)鑒定如表2所示，種皮石油醚相提取物主要成分為十六烷酸、十八烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類的相對含量占78.14%，其次是三十碳六烯，相對含量占21.86%。胚乳石油醚相提取物的主要成分為十六烷酸、十八烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類相對含量占97.57%，其次是油酸甲酯和三十碳六烯，分別占1.36%和1.07%。

2.2.2 種皮和胚乳的乙醚相提取物質(zhì)?統(tǒng)計(jì)鑒定結(jié)果如表3所示，種皮乙醚相提取物質(zhì)主要成分為十六烷酸、十八烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類相對含量達(dá)到99.99%。胚乳乙醚相提取物的主要成分為十六烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類相對含量占98.98%，其次是苯酚，相對含量占1.02%。

2.2.3 種皮和胚乳的乙酸乙酯相提取物?統(tǒng)計(jì)鑒定結(jié)果如表4所示，種皮乙酸乙酯相提取物質(zhì)主要成分為乙酸、十六烷酸、十八烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類相對含量最高為78.14%，其次是三十碳六烯，相對含量為19.60%， 單乙酸甘油酯和甘油二乙酸酯（相對含量分別為2.49%和1.36%）。胚乳乙酸乙酯相提取物中主要成分為乙酸、2-甲基丁酸、十六烷酸、十八烷酸、油酸和亞油酸，有機(jī)酸類相對含量最高達(dá)96.13%， 其次是苯酚、 油酸甲酯和三十碳六烯，其相對含量分別為1.32%、1.35%和1.21%。

2.2.4 種皮和胚乳的甲醇相提取物質(zhì)?統(tǒng)計(jì)鑒定結(jié)果顯示了19種有機(jī)化合物，如表5所示。種皮中的主要成分為乙酸、2-甲基丁酸、2-甲基巴豆酸、十六烷酸、十八烷酸、油酸、亞油酸、丙酮醇、1，3-丁二醇、糠醇、乙醇醛、糠醛、5-（羥甲基）糠醛、2-羥基 -?γ-丁內(nèi)酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、苯酚等17種有機(jī)化合物，其中有機(jī)酸類相對含量占67.27%，醛類、醇類、脂類和苯酚的相對含量分別占11.77%、9.35%、7.48%、4.13%。胚乳中的主要成分為乙酸、十六烷酸、十八烷酸、油酸、亞油酸、苯酚、1，2，3-丙三醇、5-（羥甲基）糠醛、三十碳六烯等9種有機(jī)化合物，其中有機(jī)酸類相對總含量為91.14%，烯類、醇類、醛類和酚類分別占4.10%、2.70%、1.05%和1.03%。

2.3 種皮和胚乳中提取物的比較分析

比較分析結(jié)果如表6所示，種皮和胚乳中皆含有有機(jī)酸、烯、酯、醇、醛、酚等6類相對含量較高的有機(jī)化合物。在種皮中含有20種有機(jī)化合物，其中有機(jī)酸有7種（油酸、亞油酸、十六烷酸、乙酸、十八烷酸、2-甲基丁酸、2-甲基巴豆酸），相對含量為80.49%;烯類1種（三十碳六烯），相對含量為10.37%;酯類5種（2-羥基 -?γ-丁內(nèi)酯、單乙酸甘油酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯、甘油二乙酸酯），相對含量為2.83%;醇類3種（丙酮醇、糠醇、1，3-丁二醇），相對含量為2.34%;醛類3種[5-（羥甲基）糠醛、糠醛、乙醇醛]，相對含量為2.92%;酚類1種（苯酚），相對含量為1.03%。在胚乳中含有11種有機(jī)化合物，其中有機(jī)酸6種（油酸、亞油酸、十六烷酸、乙酸、十八烷酸、2-甲基丁酸），相對含量總數(shù)為95.95%，比種皮中含量高15.46%，胚乳中不含有2-甲基巴豆酸;烯類1種（三十碳六烯），相對含量為1.59%，比種皮中含量低8.78%;酯類1種（油酸甲酯），相對含量為0.68%，比種皮中含量低1.70%;醇類1種（1，2，3-丙三醇），相對含量為0.67%，比種皮中含量低2.15%;醛類1種（5-羥甲基-糠醛），相對含量為0.26%，比種皮中含量低2.66%;酚類1種（苯酚），相對含量為0.84%，比種皮中含量低0.19%。

3?討論與結(jié)論

3.1 貴州石筆木種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的醇溶性顯著大于水溶性，種皮中的含量顯著大于胚乳

采用甲醇和水兩種不同溶劑提取貴州石筆木種子浸提液進(jìn)行試驗(yàn)，檢測白菜種子發(fā)芽率、根長和苗高的結(jié)果都小于對照，其抑制大小順序?yàn)榉N皮甲醇溶液>種子甲醇溶液>種皮水溶液>種子水溶液>胚乳甲醇溶液>胚乳水溶液，差異顯著（P<0.05），即表明貴州石筆木種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的醇溶性顯著大于水溶性，醇溶性成分比水溶性成分活躍。

貴州石筆木的種皮和胚乳中共有5類10種有機(jī)化合物，其中酸類有油酸、亞油酸、十六烷酸、十八烷酸、乙酸、2-甲基丁酸共6種;烯類有三十碳六烯1種;酚類有苯酚1種;酯類有油酸甲酯1種;醛類有5-（羥甲基）糠醛1種。種皮相對于胚乳特有的有機(jī)化合物有11種，分別為乙酸、2-甲基巴豆酸、2-羥基-γ-丁內(nèi)酯、單乙酸甘油酯、亞油酸甲酯、甘油二乙酸酯、丙酮醇、糠醇、1，3-丁二醇、糠醛、乙醇醛。胚乳相對于種皮特有的有機(jī)化合物僅有1，2，3-丙三醇1種。采用種子浸提液浸種白菜種子，通過不同處理的發(fā)芽率、主根長、幼苗高都低于對照，種皮、胚乳浸提液對白菜種子的萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用，種皮浸提液抑制作用最大，胚乳浸提液的抑制作用最小，差異顯著（P<0.05），說明貴州石筆木種子內(nèi)源抑制物質(zhì)在種皮中的含量高于胚乳。

3.2 貴州石筆木種子內(nèi)源的烯、醛、醇、酯類是起主要作用的種子萌發(fā)抑制物質(zhì)

依次采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇為浸提溶劑分離提取，得到貴州石筆木種子的種皮、胚乳各浸提液高效液相，經(jīng)GC-MS分析鑒定，得到六類20種相對含量較高的有機(jī)化合物，分別是有機(jī)酸類、烯類、酚類、酯類、醇類、醛類等，其中有機(jī)酸類相對含量占絕對優(yōu)勢，種皮中有機(jī)酸類相對含量為67.27%～99.99%、胚乳中有機(jī)酸類相對含量占91.14%～98.98%?？傮w上，在胚乳中有機(jī)酸含量大于種皮，其中可作為脂肪主要成分的油酸和亞油酸含量分別占54.45%和18.31%，這可能與種子的后熟及萌發(fā)營養(yǎng)供給有關(guān)。試驗(yàn)檢測到種皮浸提物活性顯著高于胚乳浸提物活性（P<0.05），且其烯、醛、醇和酯類含量分別高出胚乳含量的8.78%、2.66%、2.15%和1.70%，說明種子內(nèi)源的烯類、醛類、醇類、酯類是對種子萌發(fā)起主要作用的內(nèi)源抑制物質(zhì)。

3.3 100 ℃水中浸種冷卻至室溫后播種，可顯著促進(jìn)貴州石筆木種子萌芽和出苗

試驗(yàn)檢測到在不同溫度的浸提液中，抑制物活性呈現(xiàn)有規(guī)律變化，不同初始溫度處理下的種子浸提液對白菜種子萌發(fā)和生長的影響表明，浸種溫度在100 ℃時(shí)，白菜幼苗生長最差，顯著低于60～90 ℃處理的白菜種子之幼苗生長（P<0.05），說明貴州石筆木種子內(nèi)源抑制物在初始溫度為100 ℃水中的溶解度更高，結(jié)合貴州石筆木種子萌發(fā)特性及幼苗生長規(guī)律的研究報(bào)道（呂曉梅等，2017），在初始溫度為100 ℃的水中浸種自然冷卻至室溫后播種，可有效減輕其內(nèi)源抑制物質(zhì)對種子萌發(fā)的抑制作用，顯著促進(jìn)其種子的萌發(fā)和幼苗生長，有效提高苗木培育的質(zhì)量和效益，這在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

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