鄭昀曄 牛永志 索文龍 逄濤

摘?要：該研究采用脂類組學(xué)方法，系統(tǒng)地研究了煙草種子成熟過程中膜脂含量及組成比例的變化規(guī)律。結(jié)果表明：（1）構(gòu)成葉綠體和類囊體膜的重要脂類質(zhì)體膜脂的含量及其在總膜脂中的組成比例，在種子成熟的整個過程中保持下降趨勢;而構(gòu)成細胞膜的重要脂類質(zhì)外體膜脂含量在種子成熟前期則下降顯著，在授粉21 d后基本保持不變。（2）總膜脂含量的變化規(guī)律與質(zhì)體膜脂類似，但在授粉后第29天后含量卻達到穩(wěn)定狀態(tài)。（3）因油脂在種子成熟過程中不斷積累，且化學(xué)結(jié)構(gòu)與膜脂相似，質(zhì)體膜脂含量的降低可能與種子成熟過程中種子對油脂累積的持續(xù)需求以及對葉綠體及類囊體的需求降低有關(guān)。（4）質(zhì)外體膜脂含量在授粉21 d后基本保持不變的原因，可能是由于脂質(zhì)外體膜脂是細胞膜組成的主要膜脂，細胞膜在種子成熟以及成熟種子萌發(fā)過程中均發(fā)揮重要作用，因此質(zhì)外體膜脂只在種子成熟的前期有部分轉(zhuǎn)化為油脂。

關(guān)鍵詞：煙草， 種子， 成熟， 膜脂

中圖分類號：Q946.4， S572

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1512-07

Abstract：In order to clarify the change rule of membrane lipids in tobacco seed during ripening process， the change rules of membrane lipid contents and components in the seeds of tobacco were studied systematically by the method of lipidomics. The results were as follows：（1） The content of plastidic membrane lipid and its proportion in total membrane lipids decreased continuously with the ripening of the seeds， which were important lipids that constituted chloroplast and thylakoid membranes. Whereas as important lipids that constituting cell membranes， the content of extraplastidic membrane lipids decreased significantly at the early stage of seed maturation which reached a stable state at 21 d after pollination.（2） The changes of total membrane lipids content were similar to that of plastid membrane lipids， which reached a stable state at 29 d after pollination.（3） Because grease accumulated continuously during seed maturation， and its chemical structure was similar to that of membrane lipids， the reduction of plastidic membrane lipids content could be related to the sustained demand for grease accumulation during seed maturation and the decrease of demand for chloroplasts and thylakoids.（4） The reason of extraplastidic membrane lipids remaining unchanged at 21 d after pollination was related to extraplastidic membrane lipids as the major membrane lipids involving in cell membrane， and cell membrane played an important role during seed maturation and mature seed germination， therefore， it was speculated that the decreased membrane lipids were transferred to grease.

Key words：tobacco， seeds， maturation， membrane lipids

膜系統(tǒng)的變化與種子質(zhì)量、壽命和耐貯藏性等密切相關(guān)（尹田夫等，1989，1990;陳善娜等，1995;宋健和林維珍，2009）。膜脂是膜系統(tǒng)主要成分，膜脂組成及含量變化對膜系統(tǒng)的物理特性及相變溫度都有重要影響，從而影響種子活力（楊永青和汪曉峰，2004）。膜脂主要包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酸（PA）等磷脂（PL）和單半乳糖二甘油脂（MGDG）、雙半乳糖二甘油脂（DGDG）等糖脂（宋健和林維珍，2009）。其中，MGDG、DGDG和PG是組成葉綠體膜的主要脂類，因此被稱為質(zhì)體膜脂（Dormann & Benning， 2002; Kobayashi et al.， 2007），剩余的其他極性甘油酯則稱為質(zhì)外體膜脂，是植物細胞膜、線粒體膜等其他細胞器膜的主要組成脂類。

高質(zhì)量的煙草種子是煙葉生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而種子質(zhì)量與其成熟度直接相關(guān)（詹永發(fā)等，2011;張健等，2012;尚帥斌等，2014）。因此，如何精確判斷種子的成熟度并以此來指導(dǎo)種子采收是煙草種子生產(chǎn)亟待解決的問題。邵巖等（2017）系統(tǒng)研究了煙草種子成熟過程中種子形態(tài)、色澤、含水量、可溶性糖、淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、激素等變化規(guī)律;宋碧清等（2018）研究了煙草種子成熟過程中抗氧化酶活性變化與種子質(zhì)量的關(guān)系。但是，目前關(guān)于種子成熟過程中膜脂組成及含量變化的研究尚未見有報道。

本研究通過脂類組學(xué)系統(tǒng)分析煙草種子在不同成熟期的膜脂組成及含量變化，旨在揭示煙草種子在成熟過程中膜脂變化規(guī)律，建立與種子質(zhì)量的關(guān)系，從而指導(dǎo)種子采收。

1?材料與方法

1.1 材料

供試材料為煙草品種紅花大金元（Nicotiana tabacum）種子，由玉溪中煙種子有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 育苗及田間種植?按照GB/T 25241.1-2010《煙草集約化育苗技術(shù)規(guī)程》（第1部分：漂浮育苗）的方法育苗，煙苗苗齡55 d時移栽，煙株株距和行距為55 cm × 120 cm，田間管理按照GB/T 24308-2009 《煙草種子繁育技術(shù)規(guī)程》執(zhí)行。

1.2.2 種子的制作及保存?花粉采集及授粉：初花期，選長勢和品種典型性狀好的煙株，人工剝?nèi)』ㄋ帲栏墒蛊渖⒎?，?0目篩子篩出花粉，待花粉含水量 <7%在4 ℃下干燥密封保存?zhèn)溆?在煙株盛花期，摘取已開放花朵、蒴果，進行1批次授粉，授粉結(jié)束3 d后摘除幼嫩花蕾。

蒴果采摘：授粉后的第7天、第21天、第25天、第29天、第33天采摘蒴果。

種子剝?nèi)∨c保存：從新鮮蒴果中剝?nèi)》N子，經(jīng)液氮預(yù)冷1 min后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

種子的冷凍干燥和稱重：取出保存于-80 ℃超低溫冰箱的種子并置于冷凍干燥器中，-50 ℃冷凍干燥3 d至恒重。分別稱取100 mg不同成熟期的種子各5份，用于脂類的提取。

1.2.3 脂類提取及ESI-MS/MS分析?總膜脂提取步驟：（1）將種子置于已經(jīng)預(yù)熱至75 ℃的異丙醇（含0.01% 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）中固定（抑制磷脂酶的活性）15 min;（2）將種子轉(zhuǎn)移至研缽中，先充分研磨后轉(zhuǎn)入15 mL的離心管，然后使用1 mL氯仿和1 mL甲醇洗滌研缽，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至離心管中，最后在離心管中加入0.8 mL的去離子水，震蕩均勻;（3）向離心管中加入1.0 mL氯仿和1.0 mL水，震蕩均勻，離心分層;（4）用移液器吸取下層溶液（主要包括氯仿和脂類），并轉(zhuǎn)移至干凈離心管中;（5）再在原離心管中加入1.0 mL氯仿，震蕩并離心，同樣吸取下層并轉(zhuǎn)移至上次轉(zhuǎn)移的干凈離心管中;（6）重復(fù)步驟5;（7）向裝有三次提取液的離心管中加入0.5 mL的1 mol·L-1氯化鉀，震蕩均勻，離心并棄去上層的水層;（8）再向提取液中加入1 mL的去離子水，震蕩均勻，離心并棄去上層的水層;（9）使用氮吹儀吹干提取液，并用1.5 mL氯仿溶液進行溶解;（10）轉(zhuǎn)移氯仿溶液至2 mL進樣瓶中，在氮吹儀下吹干，封存待測。

1.2.4 儀器分析方法?采用電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜連用技術(shù)（ESI-MS/MS）測定膜脂含量（Welti et al.， 2002; Li et al.， 2008）。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2017和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖，使用SPSS16.0軟件進行顯著性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 種子成熟過程中膜脂總量的變化趨勢

在種子發(fā)育成熟過程中，膜脂總量呈現(xiàn)下降趨勢，下降速度先快后慢（圖1）。由圖1可知，授粉后第7天膜脂總量為23.96 nmol·mg-1，第21 天迅速下降至8.25 nmol·mg-1，第21天后膜脂總量緩慢下降，第21天和第25天差異不顯著，但顯著高于第29天和第33天，第29天和第33天差異不顯著。

2.2 種子成熟過程中質(zhì)體膜脂的變化趨勢

質(zhì)體膜脂含量和其所占膜脂百分比在種子成熟過程中呈現(xiàn)下降趨勢（表1）。由表1可知，第7天質(zhì)體膜脂含量為6.64 nmol·mg-1，第21天其含量快速下降至1.88 nmol·mg-1，之后質(zhì)體膜脂含量緩慢下降，至第29天后趨于穩(wěn)定;質(zhì)體膜脂占總膜脂的比例在第7天、第21天、第25天、第29天、第33天分別為27.64%、24.77%、19.95%、13.50%和12.90%，呈現(xiàn)下降趨勢，說明質(zhì)體膜脂含量下降速度快于其他膜脂。

質(zhì)體膜脂中DGDG、MGDG和PG的含量在種子成熟過程中呈現(xiàn)下降趨勢（圖2）。由圖2可知，DGDG和MGDG含量變化規(guī)律一致，第7天種子中DGDG和MGDG含量最高，顯著高于其他發(fā)育時期，第21天種子中DGDG和MGDG含量次之，除與第25天種子中DGDG和MGDG含量差異不顯著外，顯著高于其他時期，第25天、第29天和第33天種子中DGDG和MGDG含量無明顯差異;PG含量在第7天種子中最高，顯著高于其他時期，第21天后PG含量變化不明顯。

2.3 種子成熟過程中質(zhì)外體膜脂的變化趨勢

種子成熟過程中總質(zhì)外體膜脂含量呈現(xiàn)下降趨勢，下降速度先快后慢，但質(zhì)外體膜脂在膜脂總量中所占比例呈現(xiàn)上升趨勢（表1）。由表1可知，第7天種子中質(zhì)外體膜脂含量為15.62 nmol·mg-1，占總膜脂的比例為65.37%，第21天種子中的質(zhì)外體膜脂含量快速下降至5.35 nmol·mg-1，但占總膜脂的比例變化不明顯，即質(zhì)外體膜脂在此階段降低的速度與其他膜脂一致; 第21天后質(zhì)外體膜脂含量下降緩慢，但其占總膜脂的比例不斷上升，第33天達到80.57%，即此階段質(zhì)外體膜脂降低的速度慢于其膜脂。

各類質(zhì)外體膜脂在種子成熟過程中變化規(guī)律不同（圖3）。由圖3可知，PS在種子成熟過程中含量未發(fā)生明顯變化，PC、PE、PI和PA整體呈現(xiàn)下降趨勢。PC是細胞膜上最主要的質(zhì)外體膜脂，在發(fā)育第7天至第29天隨著種子成熟含量不斷下降，下降速度先快后慢，第33天與第29天 PC含量差異不顯著;PE含量隨著種子成熟不斷下降，下降速度先快后慢，發(fā)育第21天后PE含量變化不明顯;與PC和PE 相比，PI和PA含量在第7天至第21天間急劇下降，之后波動變化，但差異不顯著。

2.4 種子成熟過程中?；兼滈L度（ACL） 及雙鍵系數(shù)（DBI）的變化規(guī)律

膜脂?；兼滈L度和雙鍵系數(shù)是影響植物細胞膜系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)（Yu & Li， 2014）。本研究中，質(zhì)體膜脂DGDG、MGDG和PG的?；兼滈L度隨種子成熟未發(fā)生顯著改變（圖4）。由圖4可知，各類質(zhì)外體膜脂隨著種子成熟?；兼滈L度波動變化，其中PS?；兼滈L度在第7天至第21天之間變化最明顯，從36.92上升至41.66，其他質(zhì)外體膜脂的?；兼滈L度變化不明顯。同樣，絕大部分質(zhì)外體膜脂的雙鍵系數(shù)波動變化，但變化不顯著且無明顯規(guī)律（圖5）。

2.5 煙草種子成熟過程中溶血磷脂的變化規(guī)律

溶血磷脂是存在于植物體內(nèi)的一類比較特殊的極性脂類，其在植物體中的含量較少，且含量隨著環(huán)境的變化而劇烈改變（李艷等，2011）。本研究中，授粉后第7天至第21天間種子中LysoPC和LysoPE含量顯著下降，第21天后含量無顯著差異，而LysoPG在本研究的各試驗點中卻無明顯變化規(guī)律（圖6）。

3?討論

本研究中，總膜脂含量在種子的成熟進程中不斷下降，且下降速度先快后慢，在第7天至第23天間下降速度較快。這與文獻發(fā)現(xiàn)的油脂（三酯酰甘油）在種子成熟過程中變化趨勢相反（邵巖等，2017），油脂含量在第7天至第23天間快速上升。由于油脂和膜脂同屬于甘油酯并且結(jié)構(gòu)相似，推測在種子成熟過程中膜脂降解，生成二酯酰甘油（DAG），DAG在NtDGAT1和NtDGAT2作用下轉(zhuǎn)換為油脂，在種子中被作為營養(yǎng)物質(zhì)儲藏起來，用于種子后續(xù)的生理活動（陽天泉等，2013;Zhang et al.，2005）。因此，推測膜脂不僅是構(gòu)成細胞膜的重要成分，而且可能是種子中油脂合成的重要原料。

本研究通過對比質(zhì)體膜脂和質(zhì)外體膜脂的組成變化發(fā)現(xiàn)：質(zhì)體膜脂與質(zhì)外體膜脂含量變化趨勢基本一致，隨種子成熟而下降;但是質(zhì)體膜脂的下降要持續(xù)到種子發(fā)育第29天，而質(zhì)外體膜脂在種子發(fā)育第21天后就基本達到平衡，且質(zhì)體膜脂的下降幅度要遠大于質(zhì)外體膜脂。質(zhì)體膜脂是構(gòu)成葉綠體及類囊體膜的重要脂類（Dormann & Benning， 2002）。在煙草種子成熟早期，種子色澤為黃綠色，說明種子中有豐富的葉綠體，因此，此時質(zhì)體膜脂含量較高，但是隨著種子不斷成熟，煙草種子顏色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚⑸詈稚?，說明葉綠體在種子成熟過程中被降解（鄭昀曄等，2015）。煙草種子中種皮葉綠素熒光變化也反映出這一變化過程（邵巖等，2017）。成熟種子不需要光合作用，也不需要葉綠體，因此種子成熟過程中質(zhì)體膜脂的劇烈降解符合這種轉(zhuǎn)變。本研究質(zhì)外體膜脂是構(gòu)成細胞膜的重要組成脂類，隨著種子成熟，盡管發(fā)生了一定的降解，但其降低的幅度遠小于質(zhì)體膜脂，大約在種子發(fā)育第21天就已趨于穩(wěn)定。

膜脂?；兼滈L度及雙鍵系數(shù)與植物膜的流動性密切相關(guān)（Yu & Li， 2014）。本研究發(fā)現(xiàn)在煙草種子成熟過程中，膜脂碳鏈長度并未發(fā)生劇烈改變，除磷脂酰絲氨酸外，磷脂酰絲氨酸的碳鏈長度隨著種子的成熟而增加。磷脂酰絲氨酸是膜脂中極少數(shù)長鏈脂肪酸含量較高的脂類，以往研究表明其碳鏈長短變化可能與植物器官壽命密切相關(guān)（Li et al.， 2014）。種子成熟過程中少數(shù)極性脂的雙鍵系數(shù)也發(fā)生了一定的變化，但是這些變化趨勢不十分明顯。本文較系統(tǒng)研究了煙草種子成熟過程中膜脂含量及組成的變化規(guī)律，研究結(jié)果表明，隨著種子的不斷成熟，總膜脂含量不斷降低，降低速度先快后慢，種子發(fā)育第29天，總膜脂的含量基本到達穩(wěn)定的狀態(tài)。種子成熟過程中減少膜脂可能被用于種子中油脂的合成。此外，質(zhì)外體膜脂含量在種子發(fā)育第21天后就基本保持不變;而質(zhì)體膜脂（尤其是糖酯）含量下降貫穿了種子成熟的整個過程，質(zhì)體膜脂的減少可能與種子成熟過程中功能的轉(zhuǎn)變有密切相關(guān)。

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