藺曉源 徐菲 張嘉倫 趙應(yīng)松 王敏 劉杰民 胡國恒

[摘要]目的觀察健脾益腸散對潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）大鼠CD86分子（CD86）和細胞間黏附分子-1（intercellu-lar adhesion nolecule-1.ICAM-1）表達的影響，探討其對UC腸黏膜的免疫保護機制。方法將60只SD大鼠先隨機分力空白組和造模組，造模組采用2，4.6-三硝基苯磺酸（2，4.6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）溶液灌腸法制備UC大鼠模型，待模型復(fù)制成功后再將造模組隨機分為模型組、西藥組和中藥高、中、低劑量組;干預(yù)21d后，免疫組化法檢測各組大鼠結(jié)腸組織中CD86的陽性表達，Westem Blot、RT-PCR法分別檢測結(jié)腸中ICAM-1的蛋白和mRNA表達。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中CD86的陽性表達以及ICAM-1的蛋白和mRNA表達均顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，中藥高、中、低劑量組和西藥組CD86、ICAM-1的表達均不同程度地降低（P<0.05或P<0.01），且以中藥高劑量組最為明顯（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論健脾益腸散可能通過降低結(jié)腸組織中CD86、ICAM-1的表達水平起到對UC結(jié)腸黏膜的免疫保護作用。

[關(guān)鍵詞]潰瘍性結(jié)腸炎;健脾益腸散;CD86分子;細胞間黏附分子-1

[中圖分類號]R285.5;R656.9[文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.006

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colkis，UC）是一種反復(fù)發(fā)作的以腹痛、腹瀉和便血等癥狀和體征為主要臨床表現(xiàn)的特發(fā)性慢性炎癥性腸病。UC病因尚不清楚，研究認為其發(fā)病與遺傳、環(huán)境、感染、微生物群失調(diào)和免疫應(yīng)答等因素密切相關(guān)。目前UC的西醫(yī)治療藥物常包括柳氮磺胺嘧啶等氨基水楊酸制劑，布地奈德等糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤等免疫抑制劑，英夫利昔等生物制劑及微生態(tài)制劑，臨床多聯(lián)合用藥，雖有成效，但仍面臨不良反應(yīng)大、易復(fù)發(fā)等諸多問題。健脾益腸散是基于UC“本虛標實”的中醫(yī)病機組方的董菲洛教授經(jīng)驗方，臨床治療UC安全有效，并能明顯改善患者機體的免疫功能。為了進一步明確健脾益腸散治療UC的作用靶點，鑒于CD86分子（CD86）和細胞間黏附分子1（Intercellular adhesionmolecule-1.ICAM-1）異常已被證實在UC發(fā)病的免疫機制中起重要作用。因此，本研究觀察健脾益腸散對UC模型大鼠結(jié)腸組織CD86、ICAM-1表達的影響，以深入探討其對UC結(jié)腸黏膜的免疫保護機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

SD大鼠60只，SPF級，雄性，體質(zhì)量180-220g，由重慶騰鑫華阜實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK-（軍）2012-0011。飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房，飼養(yǎng)溫度21-25℃濕度50%-70%，符合飼養(yǎng)環(huán)境標準要求。所有大鼠自由飲水、進食，每2天更換一次墊料。

1.2實驗藥物

健脾益腸散全方由太子參15g，黃芪15g，白術(shù)12g，木香6g，白豆蔻6g，茯苓12g，芡實12g，敗醬草30g，補骨脂20g，炙甘草6g組成。中藥飲片均購自貴州省中醫(yī)院門診中藥房，濃縮成生藥含量分別為15、10、5g/mL的藥液冰箱冷藏備用。西藥柳氮磺吡啶腸溶片（上海福達制藥有限公司，規(guī)格：0.25g/片），配制成濃度為22.1mg/mL的藥液冷藏備用。

1.3主要試劑與儀器

CD86JCAM-1兔抗多克隆抗體（abcam），PCR引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司），引物序列：ICAM-1-F：CGGGATGGTGAAG7CTGT，ICAM-1-R：GGCGGTAATAGGTGTAAATG，產(chǎn)物片段長度200bp;GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，產(chǎn)物片段長度138bP。BCA蛋白濃度測定試劑盒（Bio-Swamp），蛋白質(zhì)Mark-cr（Thermo），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA），PCR試劑盒（KAPA Biosystems），2.4.6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma）。Z32HK高速冷凍離心機（德國Hermle），RM2235石蠟切片機（德國萊卡），MK3酶標儀（芬蘭雷勃），BX51顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（日本奧林巴斯），Mini Protean tetra cell蛋白印記系統(tǒng)、T100梯度PCR擴增儀、CheemiDoc XRS+Imager化學發(fā)光系統(tǒng)（美國BIO-RAD），Realplex 2熒光定量PCR儀（德國Eppendorf）。

1.4動物分組與模型復(fù)制

將60只大鼠先按體質(zhì)量用隨機數(shù)字法分為2組，正常組（10只）和造模組（50只）。造模組參考文獻方法[6]將大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，然后肛內(nèi)8cm處注入TNBS溶液制備UC大鼠模型。待模型復(fù)制成功后再將造模組隨機分為5組，分別為空白組、模型組、西藥組和健脾益腸散3個劑量組（簡稱中藥高、中、低劑量組），每組10只。

1.5干預(yù)與標本取材

從造模第3天起，西藥組給予0.3g/kg的柳氮磺吡啶腸溶片藥液，中藥高、中、低劑量組分別給予204、136、68g/kg的健脾益腸散藥液，模型組給予蒸餾水。灌胃體積量均為13.6mL/kg，連續(xù)灌胃21d。

空白組大鼠和各給藥組大鼠在最后一次灌胃后禁食不禁水24h，然后予以水合氯醛麻醉。冰盒上剪取距離肛門10cm處的末端結(jié)腸，其中一小段用生理鹽水漂洗后裝入凍存管中放置在-80℃冰箱中保存供Western Blot和RT-PCR檢測使用，另一小段放人多聚甲醛中供免疫組化檢測使用。

1.6指標檢測

1.6.1CD86陽性表達的免疫組化法檢測 每組隨機取出結(jié)腸組織標本5個，流水沖洗，不同濃度的乙醇逐級脫水，置人純乙醇和二甲苯的等體積混合液中透明，石蠟包埋切片，一抗（CD86抗體，稀釋比例1：100）孵育，maxvision二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3min，透明、封片。使用400倍鏡選取陽性表達（以胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為標志）不重復(fù)的5個視野拍片，最后使用圖像分析系統(tǒng)分析CD86陽性染色的平均OD值。

1.6.2ICAM-1蛋白表達的Western Blot法檢測 每組隨機取出結(jié)腸組織標本5個，按每20mg組織加入150-250uL裂解液提取蛋白，使用酶標法進行蛋白定量，制備SDS-PAGE膠（下層分離膠選用12%的膠），每孔上樣10ug蛋白，經(jīng)電泳、濕轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入一抗（ICAM-1抗體，稀釋比例1：1000）室溫孵育1h、1：10000稀釋HRP標記的二抗室溫孵育1h，顯色后將膜置于化學發(fā)光系統(tǒng)中檢測。

1.6.3ICAM-1mRNA表達的RT-PCR法檢測 每組隨機取出結(jié)腸組織標本3個，根據(jù)Real-TimePCR的操作方法進行組織總RNA的提取、cDNA第一條鏈的合成（總RNA中DNA的消除：總RNA中DNase 1的消除;反轉(zhuǎn)錄：42℃，60min;70℃，15min;16℃，hold）和PCR擴增。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件qbase plus分析每個樣本待測基因相對于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達量。

1.7統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以“x±t”表示，多組間的比較滿足正態(tài)性檢驗后，方差齊時采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane′s T2法。不滿足正態(tài)性分布的采用非參數(shù)檢驗。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠結(jié)腸組織CD86的陽性表達

與空白組比較，模型組CD86的陽性表達顯著增多（P<0.01）：各給藥組均可不同程度地降低CD86的陽性表達（P<0.05或P<0.01）：且中藥高劑量組優(yōu)于其他給藥組（P<0.05或P<0.01），中藥低劑量組不及中藥中劑量組和西藥組（P<0.05），而中藥中劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.2各組大鼠結(jié)腸組織ICAM-1的蛋白表達

與空白組比較，模型組ICAM-1蛋白表達明顯增多（P<0.01）;各給藥組與模型組比較，ICAM-1的蛋白表達均不同程度地減少（P<0.05或P<0.01），且以中藥高劑量組最為明顯（P<0.01），而中藥中、低劑量組與西藥組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖2。

2.3各組大鼠結(jié)腸組織ICAM-1mRNA表達

模型組ICAM-1mRNA表達較空白組顯著升高（P<0.01）：各給藥組ICAM-1的mRNA表達與模型組比較均不同程度地降低（P<0.05或P<0.01），且中藥高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組和西藥組（P<0.05），而中藥中、低劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

3討論

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是功能最強大的抗原提呈細胞，也是激發(fā)免疫應(yīng)答的始動細胞。DC參與UC腸道黏膜免疫激活和免疫耐受，結(jié)腸黏膜DC浸潤的頻率與UC活動性炎癥的嚴重性顯著關(guān)聯(lián)。成熟DC高表達共刺激分子CD86和黏附分子ICAM-1等，可有效激活T細胞免疫應(yīng)答。而當特定的CD86、ICAM-1等缺乏時，T細胞活化受到抑制，進而導(dǎo)致外周免疫耐受產(chǎn)生。Scarpa M等研究表明，CD86的表達在UC患者中明顯存在，而健康受試者體內(nèi)未檢測到CD86.且CD86的表達與疾病的持續(xù)時間呈負相關(guān)，其研究證實了CD86在UC發(fā)病中的主要作用。而早在Nakazawa A等探討共刺激分子CD86在人結(jié)腸上皮細胞中的表達及其在炎癥結(jié)腸黏膜T細胞活化中的作用時就發(fā)現(xiàn)，抗原提呈細胞可通過CD86在炎癥結(jié)腸黏膜中的表達促進T細胞的活化。TNBS誘導(dǎo)的UC模型大鼠結(jié)腸黏膜ICAM-1的陽性表達較正常大鼠明顯增強。柳氮磺吡啶可降低老年UC患者腸黏膜ICAM-1的mRNA表達，檢測ICAM-1水平可作為判斷UC療效的指標。我們前期的研究也表明UC模型大鼠血清ICAM-1含量較正常大鼠顯著升高，免疫組化結(jié)果則證實其在結(jié)腸中的陽性表達亦高于正常大鼠。因此，CD86和ICAM-1在UC發(fā)病的免疫應(yīng)答機制中起重要作用。

UC屬中醫(yī)學“泄瀉”“腸癖”等范疇，其本在于脾氣虧虛，其標在于氣滯、濕熱和血瘀。若飲食失攝，脾胃運化失司，則脾氣虛弱，腸胃不固。氣虛無以御邪，邪留腸間，日久不化，終致氣滯、濕熱、血瘀復(fù)合而傷，潰腸化瘍，日久則更易傷及先天腎元致使疾病纏綿不愈。王愛華教授也認為，UC的根本病機為本虛標實，脾虛失運為其本，濕熱、熱毒為其標，日久夾瘀，脾腎雙虧。因此，針對此本虛標實之證治宜扶正祛邪、標本兼治。健脾益腸散方中黃芪補氣固表、斂瘡生肌、固腸御邪為君;太子參益氣健脾，《中藥志》言其：“治脾虛泄瀉”;白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，《藥性論》言其：“主多年氣痢，止下泄”;白豆蔻化濕行氣;木香行氣止痛、抗菌止瀉，《日華子本草》言其：“止瀉，治痢疾”：敗醬草清熱行瘀消癰，共為臣藥。補骨脂補腎止瀉，《本草綱目》言其：“治腎泄，通命門”;芡實益腎補脾止瀉;茯苓健脾滲濕，共為佐藥。甘草補脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥為使?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪中的黃芪多糖對非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫均具有明顯的促進作用。太子參多糖粗提物能升高CD3、CD4、CD4/CD8.具有增強輔助性T細胞的作用，可增強免疫功能。此外，白術(shù)的免疫調(diào)節(jié)作用，茯苓、補骨脂的增強免疫、抗炎作用也得到證實。而甘草黃酮類成分是甘草用于腹部解痙、“緩急止痛”功效的主要活性成件。

課題組在前期的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，健脾益腸散可能通過促進熱休克蛋白70的表達、降低CD40分子的表達而起到對UC大鼠結(jié)腸黏膜的免疫保護作用。本研究采用經(jīng)典的TNBS/乙醇法復(fù)制UC大鼠模型，結(jié)果顯示，模型大鼠結(jié)腸CD86的陽性表達以及ICAM-1的蛋白和mRNA表達均顯著高于正常大鼠，說明UC腸黏膜的免疫應(yīng)答被有效激活。健脾益腸散高、中、低劑量均可不同程度地降低CD86和ICAM-1的表達，且以健脾益腸散高劑量效果最為顯著，也明顯優(yōu)于西藥組。同時表明健脾益腸散治療UC的作用機制可能與下調(diào)CD86的陽性表達，降低ICAM-1的蛋白和mRNA表達，進而通過調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答向免疫耐受方向發(fā)展而減輕免疫損傷有關(guān)。