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無(wú)瓣海桑果實(shí)提取物對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制研究

2019-09-10 10:55易湘茜李家怡杜正彩高程海郝二偉鄧家剛
廣西植物 2019年11期
關(guān)鍵詞:抗氧化活性神經(jīng)細(xì)胞

易湘茜 李家怡 杜正彩 高程海 郝二偉 鄧家剛

摘?要:無(wú)瓣海桑果實(shí)為真紅樹無(wú)瓣海桑的果實(shí)。研究無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響及其作用機(jī)制。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)量無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響,HE染色觀察各組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞的變化情況,并測(cè)定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力、一氧化氮(NO)含量和單胺氧化酶(MAO)活力。結(jié)果表明:與模型組相比,無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物處理組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加(P<0.05)。無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物處理組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞損傷與模型組相比明顯減少,小鼠腦部SOD酶活力和GSH-Px酶活力提高(P<0.05),NO含量和MAO活力在腦部顯著降低(P<0.05)。無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用,無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物通過(guò)提高小鼠腦內(nèi)源抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活力,降低腦部NO含量和MAO活力來(lái)提高D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)鍵詞:無(wú)瓣海桑果實(shí), D-半乳糖, 學(xué)習(xí)記憶能力, 神經(jīng)細(xì)胞, 抗氧化活性

中圖分類號(hào):Q946, R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-3142(2019)11-1534-07

Abstract:To study the effects and mechanism of different extracts of Sonneratia apetala fruit on learning and memory abilities of aging mice induced by D-galactose, the learning and memory abilities of mice were measured by Morris Water Maze Test and the changes of brain nerve cells were observed by HE staining. The activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px) , nitric oxide(NO) content, and monoamine oxidase(MAO) activity in brain tissue were measured. The results showed that compared with the model group, the escape latency of the mice treated with different extracts from the S. apetala fruit was significantly shorter than that of the model group(P<0.05), and the residence time of the target quadrant was significantly increased(P<0.05) in the water maze experiment. Compared with the model group, the brain nerve cell injury of the mice treated with different extracts was significantly decreased, and the activities of SOD and GSH-Px in the brain of the mice were increased significantly(P<0.05). The content of NO and the activity of MAO in the brain decreased significantly(P<0.05). Different extracts of S. apetala fruits can improve the learning and memory abilities of aging mice induced by D-galactose. Different extracts of S. apetala fruits may reduce the damage of nerve cells in the brain of aging mice and increase the endogenous antioxidant enzymes(SOD, GSH-Px) activity, decreased brain NO content and MAO activity, which can increase learning and memory in aging mice.

Key words:Sonneratia apetala fruit, D-galactose, learning and memory, nerve cells, antioxidant capacity

衰老是生命過(guò)程中不可抗拒的自然規(guī)律,衰老發(fā)生的重要表現(xiàn)之一就是機(jī)體抗氧化能力下降(Wickens, 2001)。在衰老過(guò)程中,隨著機(jī)體年齡的增長(zhǎng),體內(nèi)自由基增多,由其誘導(dǎo)的有害物質(zhì)增加、機(jī)體防御能力下降、抗氧化能力減弱(張丁等, 2002)。腦是機(jī)體衰老過(guò)程中最突出的器官,腦部衰老的過(guò)程中腦組織會(huì)發(fā)生一系列的變化,包括腦部神經(jīng)細(xì)胞減少,腦萎縮,抗氧化能力下降等(黃華等, 2010)。因此,尋找抗氧化活性強(qiáng)的成分是延緩衰老研究的重要工作之一。

紅樹生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶沿海潮間帶區(qū)域,是海洋植物的重要組成部分。紅樹生存環(huán)境具有高鹽、強(qiáng)光照、根部長(zhǎng)期缺氧的特異性。因此,為了抵抗這種逆境,大部分紅樹植物的根莖葉花果均有抗氧化活性。正紅樹(Rhizophora apiculata)和老鼠勒(Acanthus ilicifolius)根的正丁醇萃取物富含多酚和黃酮,能夠抑制DPPH(2,2-二苯代苦味肼基自由基清除法)和ABTS[2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽]自由基及小鼠腦部氧化應(yīng)激(Asha et al., 2012)。美洲紅樹(Rhizophora mangle)莖的正丁醇提取物能影響小鼠胃組織中SOD 酶(超氧化物歧化酶)、GPx(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)和GR 活性,提升GSH(谷胱甘肽)水平、降低LPO(過(guò)氧化脂)水平(de-Faria et al., 2012)。海漆(Excoecaria agallocha)莖中獲得的12-deoxyphorbol 13-(3E,5E-decadienoate)能抑制鼠腦細(xì)胞膜的氧化應(yīng)激(Erickson et al., 1995)。

無(wú)瓣海桑(Sonneratia apetala)為海??坪I賳棠?,原產(chǎn)孟加拉國(guó),20世紀(jì)80年代引入中國(guó),目前廣泛分布在我國(guó)海南、廣西、廣東、福建和臺(tái)灣等省(區(qū))(王瑞江等, 2002)。無(wú)瓣海桑果實(shí)可食用,可制成果酒,含有大量的氨基酸、總酚、花青素等(林海生和宋文東, 2009; 林海生等, 2009; Patra et al., 2015)。曹雷雷等(2015)從新鮮無(wú)瓣海桑果實(shí)分離得到16個(gè)化合物,其中包含新化合物蘋果酸乙基正丁基酯。孟加拉國(guó)民間用無(wú)瓣海桑的果實(shí)治療扭傷(Ganguly & Sincar,1974)。目前,中國(guó)國(guó)內(nèi)的無(wú)瓣海桑果實(shí)還處于自生自滅狀態(tài),造成海洋生物資源的巨大浪費(fèi)。因此,為了促進(jìn)無(wú)瓣海桑果實(shí)的開發(fā)利用,作者開展過(guò)多層次的研究,曾經(jīng)證實(shí)無(wú)瓣海桑果實(shí)提取物具有很強(qiáng)的體外清除自由基能力(易湘茜等,2017)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證無(wú)瓣海桑果實(shí)提取物在體內(nèi)抗氧化應(yīng)激活性,采用D-半乳糖致衰老模型,深入研究無(wú)瓣海桑果實(shí)提取物對(duì)衰老小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力及抗氧化應(yīng)激活性影響,探討其作用機(jī)制,為無(wú)瓣海桑果實(shí)的更深一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性昆明小鼠108只,體重18~22 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK桂2014-0002。常規(guī)飼養(yǎng)在動(dòng)物房?jī)?nèi),溫度為23 ℃,濕度為45%~55%,自然光線下養(yǎng)殖,晝夜比為12 h/12 h,自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2 無(wú)瓣海桑果實(shí)醇提物及不同極性提取物制備

果實(shí)采自廣西茅尾海自治區(qū)級(jí)紅樹林自然保護(hù)區(qū),經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒別為海??坪I贌o(wú)瓣海桑(Sonneratia apetala)果實(shí)。摘取新鮮的無(wú)瓣海桑果實(shí),用95%乙醇浸泡減壓濃縮后得到乙醇提取物(S. apetala fruit ethanol extract,SEE),并依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取得到乙酸乙酯提取物(S. apetala fruit ethyl acetate extract,SEAE)和正丁醇提取物(S. apetala fruit butanol extract,SBE),減壓濃縮,真空冷凍干燥后備用。

1.3 主要試劑與儀器

試劑:D-半乳糖、水溶性維生素E(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)分別為D8310、ST9160);蘇木素、伊紅、中性樹脂(BIOSWAMP公司,批號(hào)分別為PAB180015、PAB180016、PAB180017);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、單胺氧化酶(MAO)試劑盒(南京建成生物工程公司,批號(hào)分別為20170214、20170220、20170224、20170213)。

儀器:Infinite 200酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)、ST16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)、HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)、Carry 100紫外分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、CX41正置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、RM2235石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)、TB-718D石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組、衰老模型建立及給藥

適應(yīng)環(huán)境3~5 d后將小鼠按體重隨機(jī)分成空白組、模型組、陽(yáng)性組(水溶性維生素E,VE 100 mg·kg-1)、SEE高劑量組(SEE-H,250 mg·kg-1)、SEE低劑量組(SEE-L,125 mg·kg-1)、SEAE高劑量組(SEAE-H,76 mg·kg-1)、SEAE低劑量組(SEAE-L,38 mg·kg-1)、SBE高劑量組(SBE-H,19 mg·kg-1)、SBE低劑量組(SBE-L,9.5 mg·kg-1),每組12只小鼠。除空白組外,其余各組小鼠每只每日皮下注射D-半乳糖溶液,劑量為120 mg·kg-1 ,連續(xù)注射13周誘導(dǎo)小鼠建立衰老模型,空白組注射等量生理鹽水。第8周開始灌胃給藥,連續(xù)灌胃42 d??瞻捉M和模型組灌胃等量生理鹽水,灌胃量為20 mL·kg-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫臼處死小鼠,采集樣本測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),前4天進(jìn)行定位航行訓(xùn)練,每天在固定時(shí)間段內(nèi)訓(xùn)練4次,每次一個(gè)象限,將小鼠面向池壁,依次從四個(gè)象限入水點(diǎn)放入水中,記錄每只小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期),如60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)則對(duì)其進(jìn)行引導(dǎo),并在平臺(tái)上停留10 s,逃避潛伏期為60 s。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),撤去平臺(tái),記錄每只小鼠進(jìn)行原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù),以衡量小鼠對(duì)水迷宮記憶的獲取能力。

1.6 衰老小鼠腦部形態(tài)學(xué)觀察

每組隨機(jī)選取兩只小鼠脫臼處死,冰上取腦,用預(yù)冷生理鹽水沖洗除去表面血液,濾紙吸干水分后用4%多聚甲醛溶液固定,制備病理組織切片,采用HE染色對(duì)大腦組織神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行觀察,委托武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.7 組織制備及指標(biāo)測(cè)定

脫臼處死小鼠,冰上取出大腦,并用預(yù)冷的生理鹽水漂洗除去血液,用濾紙吸干水分后將腦組織移入燒杯中,用勻漿器將其勻漿,生理鹽水稀釋制備成10 %組織勻漿,按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腦組織SOD酶活力、GSH-Px酶活力、NO含量和MAO活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2?結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如表1所示,與空白組相比,模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01),模型組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01),表明D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降,衰老模型建立成功。與模型組相比,SEE-H組小鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸縮短,穿越次數(shù)顯著增加,與模型組具有顯著性差異(P<0.01)。SEAE-H和SEAE-L組小鼠的逃避潛伏期與模型組相比均具有顯著性差異(P<0.01),SEAE-H和SEAE-L組均能有效增加衰老小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(P<0.01),效果接近空白組。

2.2 各組小鼠腦部形態(tài)學(xué)觀察

研究表明,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)衰老時(shí),腦部將出現(xiàn)不同程度的萎縮、死亡(姜秀梅等,2016)。由圖1可知,空白組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞排列緊湊、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。模型組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)大量深染、細(xì)胞壞死數(shù)量多,表明給小鼠連續(xù)皮下注射D-半乳糖造成腦部萎縮壞死。陽(yáng)性組小鼠腦部有少量壞死細(xì)胞出現(xiàn)、神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,表明VE能有效改善衰老小鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死情況。SEE-H組小鼠腦部壞死細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。SEE-L組小鼠腦部有少量壞死細(xì)胞出現(xiàn)、細(xì)胞排列緊湊,表明SEE能有效改善衰老小鼠的腦部神經(jīng)細(xì)胞損傷,其中高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。SEAE-H組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、壞死細(xì)胞數(shù)量少。

SEAE-L組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰,表明SEAE能有效預(yù)防衰老導(dǎo)致的腦部神經(jīng)細(xì)胞壞死。SBE-H組小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞間隙偏大、細(xì)胞輪廓清晰,SBE-L組小鼠腦部出現(xiàn)少量壞死神經(jīng)細(xì)胞、排列緊湊,表明SBE能有效保護(hù)衰老小鼠腦部細(xì)胞、緩解由D-半乳糖造成的腦部萎縮,且高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。

2.3 各組小鼠腦組織抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,與空白組相比,模型組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著降低(P<0.01),NO含量和MAO活力顯著升高(P<0.01),表明對(duì)模型組小鼠連續(xù)注射D-半乳糖后,小鼠腦部有害物質(zhì)積累量增多、抗氧化能力下降,模型建立成功。與模型組相比,陽(yáng)性組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著增加(P<0.01),NO含量和MAO活力顯著減少(P<0.01),表明VE能有效改善衰老小鼠腦部抗氧化能力。與模型組相比,SEE-H組和SEE-L組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著升高(P<0.01),MAO活力顯著減少(P<0.01),NO含量SEE-H組顯著減少(P<0.01),SEE-L組減少(P<0.05),表明SEE能有效提高衰老小鼠腦部抗氧化能力,且高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。與模型組相比,SEAE-H組NO含量和MAO活力顯著減少(P<0.01),SEAE-L組小鼠腦部SOD酶活力顯著升高(P<0.01),NO含量和MAO活力顯著下降(P<0.01),表明SEAE能有效減少衰老小鼠腦部氧化應(yīng)激有害產(chǎn)物,低劑量效果優(yōu)于高劑量效果。與模型組相比,SBE-H組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著升高(P<0.01),NO含量和MAO活力顯著降低(P<0.01),SBE-L組小鼠腦部NO含量和MAO活力顯著降低(P<0.01),表明SBE能有效降低衰老小鼠腦部氧化應(yīng)激有害物質(zhì)累積、提高腦部抗氧化能力,抗氧化能力與給藥濃度呈一定的量效關(guān)系。

3?討論與結(jié)論

衰老是生物體隨著時(shí)間的推移所帶來(lái)的一種自發(fā)的必然過(guò)程,它是復(fù)雜的自然現(xiàn)象,表現(xiàn)為各器官組織結(jié)構(gòu)逐漸退化,生理生化功能減退,適應(yīng)性、抵抗力和自穩(wěn)機(jī)能下降。目前,用于研究衰老和癡呆的動(dòng)物模型很多,給小鼠慢性注射D-半乳糖已成為一種常見的模擬衰老動(dòng)物模型的方法,小鼠長(zhǎng)期注射D-半乳糖后, 毛發(fā)枯黃無(wú)光,行動(dòng)遲緩,學(xué)習(xí)記憶能力下降,模型組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著降低,NO含量和MAO活力顯著升高。陽(yáng)性對(duì)照水溶性維生素E能顯著改善上述指標(biāo), 表明研究所建立的衰老模型是成功的。

生物體在新陳代謝過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基,引起體內(nèi)代謝紊亂,導(dǎo)致各種疾病產(chǎn)生,加速人體衰老。因此,產(chǎn)生了自由基致衰老學(xué)說(shuō)。在衰老機(jī)制研究中,自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為在機(jī)體衰老過(guò)程中,隨著年齡的增長(zhǎng),機(jī)體防御能力下降、有害物質(zhì)增多、氧化失衡、自由基在體內(nèi)大量增多(劉靜等,2016)。SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)源抗氧化酶,對(duì)清除氧自由基,防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用(陳洪燕等,2017;張悅等,2006)。SOD 活性卻隨年齡的增加而降低,其活性與物種的壽命呈正相關(guān)。MAO是常用的衰老指示酶,其含量和活力與衰老呈正相關(guān)關(guān)系(馬志虎,2010;王潔,2010)。NO 是一種重要的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信使以及新的神經(jīng)遞質(zhì)。NO可以為介導(dǎo)神經(jīng)元對(duì)興奮性氨基酸的反應(yīng)和增強(qiáng)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力等。隨著年齡增長(zhǎng),中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NO合成減少。

本研究通過(guò)D-半乳糖建立衰老小鼠模型來(lái)研究無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物對(duì)衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶影響及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物均可以有效地提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力,縮短衰老小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期,并延長(zhǎng)其在目標(biāo)象限的停留時(shí)間(P<0.05),同時(shí)可以緩解衰老造成的腦部萎縮、死亡。通過(guò)對(duì)小鼠腦部的檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)無(wú)瓣海桑果實(shí)能夠提高衰老小鼠腦部SOD和GSH-Px酶活力,降低NO含量和MAO活力(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)瓣海桑果實(shí)不同提取物可能是通過(guò)減輕衰老小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞損傷,提高內(nèi)源抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活力,降低腦部NO含量和MAO活力來(lái)提高D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。無(wú)瓣海桑果實(shí)的粗體物中含有總酚和花青素等酚類成分。酚類化合物是植物的次生代謝產(chǎn)物,其抗氧化、抗菌、抗衰老等生物活性已成為醫(yī)學(xué)、食品、日用化工等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。曹雷雷等(2015)也從新鮮無(wú)瓣海桑果實(shí)分離鑒定了8個(gè)酚酸類單體化合物。因此,推測(cè)是無(wú)瓣海桑果實(shí)中的酚酸類成分起到了提高D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但是,具體是何種酚酸類單體化合物起到主要作用,還需要進(jìn)一步深入研究。

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