但神勇 陳維國(guó) 鄭今歡 崔志華 江華

摘要： 為了解決在蠶絲精練實(shí)際生產(chǎn)中監(jiān)測(cè)練減率的問(wèn)題，利用絲膠蛋白中氨基酸殘基與重氮鹽偶合顯色的特征反應(yīng)來(lái)推算練減率。文章首先繪制了氨基酸模擬絲膠蛋白偶合顯色的吸光度—氨基酸濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并且研究了重氮鹽的穩(wěn)定性、偶合反應(yīng)pH值對(duì)偶合吸光度的影響，以及絲膠蛋白堿水解后的沉淀物成分。結(jié)果表明，在0℃時(shí)重氮鹽能穩(wěn)定保存，但溫度升高會(huì)導(dǎo)致其不穩(wěn)定;偶合反應(yīng)pH值控制在10左右時(shí)，偶合效率較高。由于精練殘液堿水解后與重氮鹽偶合顯色推導(dǎo)的練減率較實(shí)際練減率低3%～4%，絲膠蛋白堿水解沉淀物不含絲膠成分，因此加上實(shí)驗(yàn)誤差，能夠反映實(shí)際生產(chǎn)中蠶絲精練的脫膠情況。

關(guān)鍵詞： 氨基酸;絲膠;重氮鹽;偶合反應(yīng);練減率;定量分析

中圖分類號(hào)： TS143.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)： 1001-7003（2019）02-0013-06

引用頁(yè)碼： 021103

Abstract： In order to realize monitoring degumming loss percentage in real production of silk refining， degumming loss percentage was reckoned based on the characteristic reaction of coupling coloration of amino acid residues in sericin with diazonium salt. In this study， the standard curve of absorbance-amino acid concentration of amino acid mimicking protein-coupled coloration was drawn first， and researches were conducted on stability of diazonium salt， effect of coupling reaction pH on coupled absorbance， and precipitation composition produced via sericin basic hydrolysis. The results show that diazonium salt can be stably stored at 0℃， but it will become instable as the temperature rises; coupling efficiency remains high as long as coupling reaction pH is controlled around 10. The degumming loss percentage reckoned after basic hydrolysis of bast liquor and coupling coloration of diazonium salt is lower than the real value by 3% to 4%， basic hydrolysis precipitation of sericin contains no glue-like component， and there exist experimental errors. In view of this， the results can reflect degumming of silk refining in actual production reliably.

Key words： amino acid; sericin; diazonium salt; coupling reaction; degumming loss percentage; quantitative analysis

蠶絲是一種天然蛋白質(zhì)纖維，物理性能優(yōu)異，應(yīng)用歷史悠久，被譽(yù)為纖維皇后。蠶絲由兩根單纖維借絲膠粘合包覆而成，外層為絲膠蛋白，內(nèi)層即為絲素蛋白，蠶絲脫去絲膠的過(guò)程稱為精練。不同種類的蠶絲中，絲素和絲膠蛋白的含量不盡相同，但大體上說(shuō)，絲膠蛋白的含量一般為20%～30%[1-2]。

蠶絲脫膠的練減率直接影響纖維的服用性能及纖維的物理性能。練減率過(guò)低，部分絲膠還殘留在絲素上，蠶絲手感僵硬、泛黃;練減率過(guò)高，絲膠全部除去，還有部分絲素被溶落，造成蠶絲損傷，強(qiáng)度下降。如何控制蠶絲練減率來(lái)保證練白絲綢的質(zhì)量，一直以來(lái)都是蠶絲精練生產(chǎn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，目前工廠生產(chǎn)中都是憑借經(jīng)驗(yàn)來(lái)制定生產(chǎn)工藝，控制絲綢的練減率。但是，不同品種的蠶絲其絲膠含量有一定的差異，即使是同樣品種的蠶絲，當(dāng)制造不同緊密程度、不同織物結(jié)構(gòu)的絲綢產(chǎn)品時(shí)，溫度、時(shí)間等工藝參數(shù)對(duì)練減率的高低都有影響，憑借經(jīng)驗(yàn)往往難以控制好練減率。所以，對(duì)蠶絲精練過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，可有效地提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

Sluyterman L A[3]、Sengupta S等[4]研究了酪氨酸、組氨酸與Pauly試劑生成有色化合物的機(jī)理。為此，本文研究了酪氨酸、組氨酸、色氨酸與重氮苯磺酸鹽偶合顯色反應(yīng)[5-9]，通過(guò)測(cè)試吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后對(duì)精練中脫落下來(lái)的絲膠蛋白進(jìn)行偶合反應(yīng)，測(cè)試其吸光度，利用氨基酸偶合標(biāo)準(zhǔn)曲線，反向推算出練液中絲膠蛋白含量，進(jìn)而計(jì)算出練減率。本文為工廠實(shí)際生產(chǎn)提出了一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蠶絲練減率的便捷方法，氨基酸偶合反應(yīng)機(jī)理。

1?實(shí)?驗(yàn)

1.1?材料及儀器

材料：11160蠶絲電力紡生坯布（浙江同輝紡織有限公司），精練劑（工業(yè)級(jí)）、純堿（工業(yè)級(jí)）、泡花堿（工業(yè)級(jí)）、保險(xiǎn)粉（工業(yè)級(jí)）、氫氧化鈉（AR）（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），濃鹽酸（上海三鷹化學(xué)試劑有限公司），尿素（AR）（無(wú)錫市展望化工試劑有限公司），亞硝酸鈉（AR）、對(duì)氨基苯磺酸（AR）、色氨酸（AR）、組氨酸（AR）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），酪氨酸（AR）（上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）。

儀器：紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），VARIO MICRO cube有機(jī)元素分析儀（德國(guó)Elements公司），掃描電鏡-能譜儀（英國(guó)牛津儀器公司），PHS-3C精密臺(tái)式pH計(jì)（杭州奧立龍儀器有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司），分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2?方?法

1.2.1?重氮鹽的制備

分別取3.20×10-5、4.27×10-5、5.34×10-5、6.41×10-5、7.48×10-5、8.55×10-5mol的對(duì)氨基苯磺酸至小燒杯中，各加入對(duì)氨基苯磺酸1.5倍量的鹽酸，在冰浴條件下，再加入對(duì)氨基苯磺酸1.2倍量的亞硝酸鈉，反應(yīng)30min，然后用淀粉碘化鉀試紙檢測(cè)亞硝酸是否過(guò)量，如果試紙取出3s內(nèi)變藍(lán)，則需加入尿素除去過(guò)量的亞硝酸鈉。

1.2.2?重氮鹽穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制備好的重氮鹽分別放置于0℃和20℃下0、1、2、4、12h;取出與氨基酸偶合反應(yīng)，測(cè)其吸光度。

1.2.3?偶合過(guò)程pH值對(duì)吸光度的影響實(shí)驗(yàn)

調(diào)節(jié)偶合反應(yīng)pH值，依次為8、9、9.5、10、10.5、11、12;反應(yīng)完全后測(cè)其吸光度。

1.2.4?氨基酸模擬絲膠蛋白偶合顯色實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)三種氨基酸進(jìn)行偶合實(shí)驗(yàn)，并用紫外-可見(jiàn)光光譜測(cè)試分析。參照絲膠中三種氨基酸的質(zhì)量比（酪氨酸︰組氨酸︰色氨酸=9.8︰2.8︰1）配制6組氨基酸混合物，如表1所示。

偶合顯色反應(yīng)：將配好的氨基酸溶液置于冰浴條件下，然后將制備好的重氮鹽逐滴加入氨基酸溶液中，調(diào)節(jié)pH值至10，反應(yīng)20min;取相同體積的偶合溶液，測(cè)試吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5?蠶絲脫膠實(shí)驗(yàn)

參照工廠蠶絲精練工藝進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)，具體工藝如表2所示。

取干質(zhì)量為1g左右的蠶絲生坯布，按照表2精練工藝進(jìn)行脫膠，計(jì)算實(shí)際練減率，收集精練殘液，加入6mol/L的NaOH，在100℃下水解4h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6?精練液絲膠蛋白重氮偶合實(shí)驗(yàn)

將水解后的絲膠液與重氮鹽進(jìn)行偶合反應(yīng)，測(cè)試偶合溶液吸光度;根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)工作曲線推算氨基酸含量，進(jìn)而計(jì)算絲膠蛋白含量，得出推導(dǎo)練減率。

1.2.7?絲膠液水解沉淀物分析實(shí)驗(yàn)

在精練殘液中加入NaOH，配成濃度為6mol/L的NaOH溶液在100℃下水解4h，然后將溶液與沉淀物離心分離，收集沉淀物，重復(fù)水洗離心6次以除去里面的鹽分，烘干后稱重。采用VARIO MICRO cube有機(jī)元素分析儀（N、C、H、S模式）及掃描電鏡-能譜儀對(duì)沉淀物進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試3次，取其平均值。

2?結(jié)果與分析

2.1?重氮鹽穩(wěn)定性分析

重氮鹽不穩(wěn)定，容易放出氮?dú)舛纸?，?duì)存放條件要求較苛刻。為此，利用重氮鹽與酪氨酸偶合反應(yīng)后的吸光度為衡量指標(biāo)，對(duì)重氮鹽存放溫度、時(shí)間進(jìn)行測(cè)試。

制備好的重氮鹽在0℃條件下保存1h后，吸光度急劇下降;2h后，吸光度基本為零;重氮鹽在20℃條件下放置1h后，其吸光度接近零。這表明重氮鹽在0℃條件下，僅能保存1h左右，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重氮鹽很快分解，不能進(jìn)行偶合反應(yīng);在20℃條件下，重氮鹽很快分解，不便保存;升高溫度有利于偶合反應(yīng)進(jìn)行，但重氮鹽同樣容易分解。所以重氮鹽應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，以防分解;偶合反應(yīng)溫度也應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行[10-11]。

2.2?偶合過(guò)程pH值對(duì)偶合反應(yīng)吸光度的影響

重氮鹽與氨基酸偶合反應(yīng)對(duì)pH值比較敏感，過(guò)酸或者過(guò)堿性對(duì)偶合過(guò)程都有較大影響，合適的pH值對(duì)偶合反應(yīng)及吸光度的影響尤為重要。

將配制好的重氮鹽與酪氨酸在不同pH值下進(jìn)行偶合反應(yīng)。偶合pH值為8～10時(shí)，吸光度隨著偶合pH值增大而逐漸增大;pH值為10～12時(shí)，吸光度隨著偶合pH值增大而快速下降。這是因?yàn)樵谌鯄A性條件下，酚羥基容易解離為ArO-，它比酚羥基更容易進(jìn)行親電取代反應(yīng)。pH值太高，重氮鹽會(huì)轉(zhuǎn)化為不活潑的重氮酸鹽而難以發(fā)生偶合反應(yīng);pH值太低，芳胺離子不易水解成芳胺而失去對(duì)芳環(huán)的親電取代能力。綜上可知，當(dāng)pH值為10的時(shí)候，更有利于偶合反應(yīng)[12]。

2.3?氨基酸模擬絲膠蛋白偶合顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)大量篩選，發(fā)現(xiàn)只有酪氨酸、組氨酸、色氨酸可與重氮鹽進(jìn)行偶合反應(yīng)，單品酪氨酸、組氨酸、色氨酸與重氮鹽偶合反應(yīng)紫外-可見(jiàn)光譜。由三種氨基酸混合與制備好的重氮鹽進(jìn)行偶合反應(yīng)，偶合產(chǎn)物紫外可見(jiàn)光吸收光譜。

酪氨酸偶合產(chǎn)物在478nm處有吸收峰，組氨酸、色氨酸在可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有明顯吸收峰。在絲膠蛋白中，組氨酸、色氨酸含量較少，而酪氨酸含量相對(duì)較高，在絲膠蛋白中約為5%。吸光度隨著氨基酸濃度的增加而逐漸增大，曲線在478nm處有吸收峰，從而選取478nm處吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

得線性方程為：A=0.56108C-0.02022，式中A表示吸光度值;C表示酪氨酸濃度。線性因子為0.99745，線性關(guān)系良好。

2.4?精練液絲膠蛋白偶合顯色性能

精練液絲膠蛋白偶合吸光度曲線。

絲膠蛋白偶合光譜曲線在可見(jiàn)光區(qū)與氨基酸偶合光譜曲線基本一致，在478nm處皆有波峰出現(xiàn)，因此氨基酸模擬絲膠蛋白偶合曲線是可行的。

蠶絲絲膠含量因不同種類蠶絲而不同，如表3所示，實(shí)際練減率為23%左右，根據(jù)偶合標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)的練減率為20%左右，絲膠蛋白水解液偶合推導(dǎo)練減率相比實(shí)際練減率存在3%～4%的差。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白水解后有少量沉淀物產(chǎn)生，該沉淀雜質(zhì)可能不參與反應(yīng)，減少了推導(dǎo)練減率的值。所以，有必要進(jìn)一步對(duì)絲膠水解沉淀物進(jìn)行分析。

2.5?絲膠水解液沉淀物分析

對(duì)絲膠水解沉淀物進(jìn)行水洗離心分離收集，平行三次實(shí)驗(yàn)，如表4所示;然后對(duì)沉淀物進(jìn)行有機(jī)元素分析，結(jié)果如表5所示。

由表4可以算出，三次沉淀平均含量為3.38%，但并不能確定沉淀是否是絲膠溶落物，因此對(duì)其沉淀物進(jìn)行有機(jī)元素分析。由表5分析結(jié)果看出，N、C、H的質(zhì)量百分含量都較低，并不是氨基酸的元素含量，雜質(zhì)里面可能還有少量的氨基酸未分離出來(lái)，以及樣品還殘留少量的水分，導(dǎo)致還能檢測(cè)出少量的N、C、H。為了進(jìn)一步分析沉淀物成分，對(duì)其進(jìn)行了EDS測(cè)試。

該沉淀物主要成分是Si、O，并含有少量的C、Na、Al等。由此分析認(rèn)為，沉淀物主要是一些含硅的復(fù)雜化合物，這可能對(duì)絲膠蛋白水解液偶合推導(dǎo)練減率結(jié)果產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致推導(dǎo)練減率的下降。根據(jù)表2可知精練過(guò)程中1g蠶絲生坯布約加入0.044g泡花堿，泡花堿及精練劑在強(qiáng)堿高溫的作用下可能會(huì)形成復(fù)雜硅膠沉淀，而收集的沉淀物為0.034g，這與加入的泡花堿有一定差值，反之前面推導(dǎo)練減率加上該沉淀物含量則與實(shí)際練減率基本對(duì)應(yīng)。但該沉淀物可能并不是絲膠溶落物，推導(dǎo)練減率相比實(shí)際練減率低則是由于絲膠蛋白偶合反應(yīng)率較低，而氨基酸偶合反應(yīng)率較高，這也會(huì)對(duì)推導(dǎo)練減率造成影響。該沉淀物結(jié)構(gòu)及來(lái)源還尚不明確，是否是泡花堿等形成的復(fù)雜硅膠也還需進(jìn)一步深入研究。

3?結(jié)?論

本文借助氨基酸重氮偶合顯色特征反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，通過(guò)對(duì)精練液絲膠蛋白水解氨基酸的測(cè)試，利用方程A=0.56108C-0.02022反向間接地推算出精練液中多肽蛋白的含量，為實(shí)際生產(chǎn)提供了一種監(jiān)測(cè)蠶絲練減率的簡(jiǎn)便方法。

研究表明，重氮苯磺酸鹽非常容易分解，應(yīng)在0℃條件下配制并及時(shí)使用;調(diào)控pH值為10時(shí)，偶合效率最高，吸光度最大;氨基酸組合模擬絲膠蛋白偶合顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算推導(dǎo)出練減率為20%左右，實(shí)際練減率則約為23%，而精練下來(lái)的絲膠蛋白水解過(guò)程產(chǎn)生含量338%的沉淀物。測(cè)試推導(dǎo)出的練減率加上沉淀物含量能較好地對(duì)應(yīng)實(shí)際精練脫膠，可以反映蠶絲精練過(guò)程的實(shí)際脫膠情況。精練液水解產(chǎn)生的沉淀物成分從有機(jī)元素分析和EDS結(jié)果來(lái)看可能是一些含硅復(fù)雜化合物，可能是泡花堿等形成的復(fù)雜硅膠，也可能是泡花堿吸附了絲膠蛋白大分子形成的沉淀物，但其形成原因及具體結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫彩娥， 李肖舟， 曹錦如. 不同蠶品種繭層絲膠含量的調(diào)查[J]. 蠶桑通報(bào)， 1992，23（3）： 47-49.

SUN Caie， LI Xiaozhou， CAO Jinru. Investigation on the content of sericin in different silkworm varieties[J]. Bulletin of Sericulture，1992，23（3）： 47-49.

[2]李紹峰， 虞曉華. 桑蠶雌雄蠶絲氨基酸成分分析[J]. 江蘇蠶業(yè)， 2012， 34（2）： 12-15.

LI Shaofeng， YU Xiaohua. Analysis of amino acid composition of silkworm male silkworm[J]. Jiangsu Sericulture，2012， 34（2）： 12-15.

[3]SLUYTERMAN L A. The effect of oxygen upon the micro determination of histidine with the aid of the pauly reaction[J]. Biochimica Et Biophysica Acta， 1960， 38（2）： 218-221.

[4]SENGUPTA S， BHATTACHARYYA S. Aqueous heck reaction of amino acid derived arenediazonium salts： semisynthetic modification of phenylalanine and tyrosine[J]. Tetrahedron Letters， 1995， 36（25）： 4475-4478.

[5]郭旭， 翁連進(jìn)， 甘林火， 等. Pauly試劑顯色測(cè)定L-酪氨酸的研究[J]. 化工科技， 2006，14（5）： 4-7.

GUO Xu， WENG Lianjin， GAN Linhuo，et al. Study on determination of the L-tyrosine with pauly reagent[J]. Science & Technology in Chemical Industry， 2006，14（5）： 4-7.

[6]鄭今歡， 邵建中， 劉今強(qiáng). 蠶絲絲素蛋白中酪氨酸分布的初探[J]. 紡織學(xué)報(bào)， 2001，22（6）： 2， 7-9.

ZHENG Jinhuan， SHAO Jianzhong， LIU Jinqiang. Studies on the distribution of tyrosine in silk fibroin[J]. Journal of Textile Research，2001，22（6）： 2， 7-9.

[7]林宇燕. 組氨酸測(cè)定方法的建立[J]. 職業(yè)與健康， 2008，24（8）： 734-736.

LIN Yuyan. Establishment of a method for histidine determination[J]. Occupation and Health， 2008，24（8）： 734-736.

[8]何俊鋒， 張偉國(guó). 發(fā)酵液中L-組氨酸的定性定量測(cè)定[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2006（4）： 56-58， 112.

HE Junfeng， ZHANG Weiguo. Quantitative and quantitative determination of L-histidine in fermentation broth[J]. Journal of Food Science and Biotechnology， 2006（4）： 56-58， 112.

[9]鄭今歡， 周嵐， 邵建中. 蠶絲絲素中色氨酸含量及其在絲素纖維中的徑向分布研究[J]. 高分子學(xué)報(bào)， 2005（2）： 161-166.

ZHENG Jinhuan， ZHOU Lan， SHAO Jianzhong. Studies on content and distribution of tryptophan in silk fiber[J]. Acta Polymerica Sinica， 2005（2）： 161-166.

[10]何鎧君， 王宗乾， 陳維國(guó)， 等. 三氟乙酸法制備鄰硝基苯胺重氮鹽及其穩(wěn)定性分析[J]. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 33（1）： 16-19.

HE Kaijun， WANG Zongqian， CHEN Weiguo， et al. Preparation of O-nitroaniline diazonium salt with trifluoroacetic acid and its stability analysis[J]. Journal of Zhejiang Sci-Tech University， 2015， 33（1）： 16-19.

[11]蘇彥雷， 劉建芳， 林克江， 等.量子化學(xué)計(jì)算法對(duì)合成中4個(gè)芳香重氮鹽穩(wěn)定性的分析[J]. 海峽藥學(xué)， 2013， 25（8）： 186-188.

SU Yanlei， LIU Jianfang， LIN Kejiang， et al. The analysis of stability of four aromatic diazonium salts in synthetic process with Quantum chemistry calculation method[J]. Strait Pharmaceutical Journal， 2013， 25（8）： 186-188.

[12]葉曦雯， 李引， 牛增元， 等. 23種致癌芳香胺的顯色法測(cè)定[J]. 紡織學(xué)報(bào)， 2012， 33（12）： 58-63.

YE Xiwen， LI Yin， NIU Zengyuan，et al. Chromogenic method determination of 23 kinds of carcinogenic aromatic amines[J]. Journal of Textile Research， 2012， 33（12）： 58-63.