朱勝楠 張靖 譚親友 胡騫 蘇華珍 黃少遠(yuǎn) 劉芳

中圖分類號 R969；R541 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0216-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.15

摘 要 目的：觀察甘草水提物對雷公藤甲素致大鼠急性肝損傷的改善作用及對其體內(nèi)IL-10、TNF-α水平的影響。方法：60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組（異甘草酸鎂）和甘草水提物低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M、模型組大鼠灌胃等容生理鹽水，陽性對照組大鼠灌胃異甘草酸鎂藥液（13.5 mg/kg），甘草水提物低、中、高劑量組大鼠灌胃甘草水提物藥液（120、240、480 mg/kg，以提取物量計），給藥體積均為1 mL，每天1次，連續(xù)給藥7 d。第8 天時，模型組、陽性對照組和甘草水提物各劑量組大鼠均一次性灌胃雷公藤甲素藥液（0.6 mg/kg）以建立急性肝損傷模型。采用蘇木精-伊紅染色法檢查大鼠肝組織病理學(xué)變化；采用酶偶聯(lián)反應(yīng)法檢測各組大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性；采用Western blotting法檢測大鼠肝組織中白細(xì)胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化，血清中ALT、AST活性均顯著升高，肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高、IL-10蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，甘草水提物各劑量組大鼠肝組織病理學(xué)變化程度明顯減輕；除甘草水提物低劑量組大鼠血清中AST活性外，甘草水提物各劑量組大鼠血清中ALT、AST活性和肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低，肝組織中IL-10蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：甘草水提物能減輕雷公藤甲素所致大鼠急性肝損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)促炎因子TNF-α的表達(dá)、上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 甘草水提物；雷公藤甲素；大鼠；急性肝損傷；白細(xì)胞介素10；腫瘤壞死因子α

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the improvement effects of water extract of Glycyrrhiza uralensis on acute hepatic injury caused by triptolide and its effects on the levels of IL-10 and TNF-α in rats. METHODS： A total of 60 healthy male SD rats were randomized into blank control group， model group， positive control group （magnesium isoglycyrrhizinate） and G. uralensis water extract low-dose， middle-dose and high-dose groups. Blank control group and model group were given isochoric normal saline intragastrically； positive control group was given Magnesium isoglycyrrhizinate liquid intragastrically （13.5 mg/kg）； G. uralensis water extract low-dose， middle-dose and high-dose groups were given G. uralensis water extract intragastrically 1 mL （120， 240， 480 mg/kg， by the amount of extract）， qd， for consecutive 7 d. At 8th day of administration， model group， positive control group and G. uralensis water extract groups were given Triptolide liquid intragastrically （0.6 mg/kg） to establish acute liver injury model. HE staining was used to detect the pathological changes of liver tissue in rats. The activities of ALT and AST in serum were determined by enzyme coupling reaction. The protein expression of IL-10 and TNF-α in liver tissue were analyzed by Western blotting. RESULTS： Compared with blank control group， obvious pathological changes of liver tissue in rats were observed in model group； serum activities of ALT and AST， the protein expression level of TNF-α in liver tissue were increased significantly， while the protein expression level of IL-10 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， pathological changes of liver tissue were relieved significantly. Except for the activity of AST in serum of rats in G. uralensis water extract low-dose group， the activities of ALT and AST in serum， the protein expression level of TNF-α in liver tissue were decreased significantly in G. uralensis groups， while the protein expression level of IL-10 in liver tissue was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： G. uralensis water extract can relieve triptolide-induced acute liver injury in rats， the mechanism of which may be associated with expression down-regulation of pro-inflammatory factor TNF-α and expression up-regulation of anti-inflammatory factor IL-10.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis water extract； Triptolide； Rats； Acute liver injury； IL-10； TNF-α

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科甘草屬多年生草本，其藥用部位是根及根莖[1]。中醫(yī)上稱為“國老”的甘草，因其具有“能補(bǔ)、能和、能緩”的藥性，在臨床上多用于緩和藥性及降低藥物毒性，其應(yīng)用極其廣泛，無論在時方還是經(jīng)方中皆有出現(xiàn)[1]。已有文獻(xiàn)和長期臨床實(shí)踐表明，甘草聯(lián)用其他藥物后，可能會改變藥物的代謝，從而影響藥物藥效并中和藥物毒性[2]。雷公藤甲素是從衛(wèi)茅科植物雷公藤（Tripteryginum wilfordii Hook. f.）中提取所得的活性成分，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤和抗生育等作用[3]；同時，雷公藤甲素也是雷公藤的主要毒性成分，其所導(dǎo)致的肝損傷較為常見且機(jī)制復(fù)雜[4]。研究表明，甘草對雷公藤類藥物具有確切的減毒作用[5]，但是其減毒作用機(jī)制尚未明確。本文通過考察甘草水提物對雷公藤甲素致急性肝損傷模型大鼠的減毒作用及對其體內(nèi)白細(xì)胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的影響，旨在進(jìn)一步探討甘草水提物對雷公藤甲素致肝臟毒性的減毒作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Discovery專用型十萬分之一分析天平（美國奧豪斯儀器上海有限公司）；Mini Protean Tetra小型垂直電泳儀、Gel Doc 2000型凝膠成像儀、Chemi Doc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國Bio-Rad 公司）；5424R型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Nanodrop-2000型超微量核酸蛋白定量儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

甘草水提物（西安瑞鴻生物技術(shù)有限公司，批號：20150901，甘草酸鈉鹽含量：11.8%）；雷公藤甲素對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：D1601041，純度：≥98%）；異甘草酸鎂原料藥（江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司，批號：1604081201，純度：≥98%）；鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠IL-10單克隆抗體、鼠TNF-α單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（美國Proteintech公司）；RIPA組織裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；電化學(xué)發(fā)光法（ECL）Plus發(fā)光液（北京Bridgen橋生物公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 動物

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2016-0001。實(shí)驗(yàn)期間動物自由攝食和飲水，并保持室內(nèi)溫度為18～22 ℃、相對濕度為40%～60%。

2 方法

2.1 分組、造模、給藥與取樣

取大鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組和甘草水提物低、中、高劑量組，每組10只。取甘草水提物、雷公藤甲素、異甘草酸鎂，以二甲基亞砜（DMSO）充分溶解（DMSO體積比均小于1%），然后以生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度。空白對照組、模型組大鼠均灌胃等容生理鹽水，陽性對照組大鼠灌胃異甘草酸鎂藥液（13.5 mg/kg，劑量根據(jù)本課題組前期研究及文獻(xiàn)[6]設(shè)置），甘草水提物低、中、高劑量組大鼠灌胃甘草水提物藥液（120、240、480 mg/kg，劑量根據(jù)臨床用量換算結(jié)果設(shè)置，以提取物量計），給藥體積均為1 mL，每天1次，連續(xù)給藥7 d。第8天時，除空白對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水外，模型組、陽性對照組和甘草水提物各劑量組大鼠均一次性灌胃雷公藤甲素藥液（0.6 mg/kg，劑量根據(jù)本課題組前期研究及文獻(xiàn)[6]設(shè)置）以建立急性肝損傷模型。

第9 天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于各組大鼠腹主動脈采血3 mL，3 000 r/min離心10 min后，取其上層血清約1 mL，于-20 ℃條件下保存。處死所有大鼠，迅速剖取肝臟相同部位組織，以生理鹽水漂洗后，一部分用作組織病理學(xué)檢查，另一部分存于凍存管投于液氮并在-80 ℃條件下保存。通過檢測大鼠血清肝功能指標(biāo)并觀察其肝組織病理學(xué)變化，確定其急性肝損傷模型是否成功建立。

2.2 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法檢查。取大鼠肝右葉相同部位約1 cm×1 cm×0.5 cm 的組織小塊，放入10%甲醛溶液中固定，然后脫水、透明、石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)切片及HE染色。在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.3 大鼠血清肝功能指標(biāo)檢測

取大鼠血清樣品送至桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用酶偶聯(lián)法檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。

2.4 大鼠肝組織中IL-10、TNF-α的蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blotting法進(jìn)行檢測。取大鼠肝組織50 mg，以RIPA組織裂解液-PMSF混合液（體積比為100 ∶ 1）進(jìn)行處理，將裂解后的樣品進(jìn)行渦旋震蕩、4 ℃下12 000 r/min離心，吸取上清液得到肝組織總蛋白。肝組織總蛋白以BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，再經(jīng)變性處理后采用SDS分離膠套裝進(jìn)行分離（根據(jù)目的蛋白IL-10和TNF-α的分子量大小選擇12%分離膠和5%濃縮膠），濕法轉(zhuǎn)膜，再以洗膜液配制的5%脫脂奶粉溶液在4 ℃下封閉過夜；然后加入鼠TNF-α單克隆抗體（1 ∶ 2 500）、鼠IL-10單克隆抗體（1 ∶ 2 500）、鼠β-actin單克隆抗體（1 ∶ 1 000），在4 ℃下孵育過夜；以TBS緩沖液洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（二抗，1 ∶ 5 000），于室溫下孵育1 h；以TBS緩沖液洗滌3次后，采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光顯影，檢測蛋白條帶。采用Image J 2X軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘草水提物對雷公藤甲素致急性肝損傷模型大鼠肝組織病理學(xué)的影響

空白對照組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯清晰，細(xì)胞核大且圓，核膜清晰且核仁明顯，無細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象；模型組大鼠肝組織細(xì)胞高度腫脹，胞質(zhì)透亮，排列紊亂，肝竇受壓消失；陽性對照組大鼠肝組織細(xì)胞未見明顯腫脹，排列較整齊，肝竇可見；甘草水提物低劑量組大鼠肝組織部分細(xì)胞稍腫脹，排列較紊亂，肝竇不太明顯；甘草水提物中、高劑量組大鼠肝組織細(xì)胞腫脹不明顯，排列較整齊，肝竇可見。各組大鼠肝組織病理學(xué)變化顯微圖見圖1。

3.2 甘草水提物對雷公藤甲素致急性肝損傷模型大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT活性均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和甘草水提物低、中、高劑量組大鼠血清中ALT活性均顯著降低，甘草水提物中、高劑量組大鼠血清中AST活性均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。

3.3 甘草水提物對雷公藤甲素致急性肝損傷模型大鼠肝組織中IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高，IL-10蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和甘草水提物低、中、高劑量組大鼠肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低，IL-10蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠肝組織中IL-10、TNF-α蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平柱形圖見圖3。

4 討論

雷公藤甲素毒性作用的主要靶器官之一為肝臟[7]，其可導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死、膜通透性增強(qiáng)，引起繼發(fā)性肝細(xì)胞壞死和肝內(nèi)炎癥反應(yīng)[8]，故以雷公藤甲素建立的藥物性肝損傷模型成為以中藥建立肝損傷模型中的代表。甘草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，有祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[9]，中藥方劑中多見配伍甘草以緩藥性。研究表明，甘草酸二銨可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450（CYP）3A4活性上調(diào)和降低活性氧簇（ROS）水平，從而減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性[10]。因此，考察甘草水提物對雷公藤甲素誘導(dǎo)的急性肝毒性模型動物的肝損傷、血清生化指標(biāo)及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有重要意義。

異甘草酸鎂是一種肝細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能的作用，其對四氯化碳引起的大鼠慢性肝損傷具有顯著改善效果，能抑制血清轉(zhuǎn)氨酶的升高，減輕肝細(xì)胞變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，從而改善肝功能、減輕肝組織炎癥活動度及纖維化程度[11]。因此，本研究選擇異甘草酸鎂作為陽性藥物。

TNF-α是一種主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的、具有多種生物活性的多肽調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中起主要介導(dǎo)作用，而機(jī)體免疫反應(yīng)在急性肝損傷病理過程中起著重要作用[12]。當(dāng)發(fā)生肝損傷時，TNF-α表達(dá)水平顯著升高，而降低TNF-α的表達(dá)水平可以減輕肝細(xì)胞的壞死和凋亡，減少中性粒細(xì)胞的募集和淋巴細(xì)胞浸潤，繼而起到保肝作用[13-14]。IL-10是由包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞以及包括肝臟在內(nèi)的許多器官分泌的細(xì)胞因子合成抑制因子[15]，是一個關(guān)鍵的肝臟保護(hù)性細(xì)胞因子，提高IL-10表達(dá)水平可抑制部分細(xì)胞合成和釋放促炎介質(zhì)，從而抑制炎癥反應(yīng)[16]。TNF-α和IL-10分別作為促炎因子和抗炎因子，兩者間的平衡關(guān)系在炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，肝損傷早期的炎癥反應(yīng)發(fā)生主要是促炎因子和抗炎因子間的平衡被打破所致；若炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，則會引起機(jī)體免疫缺失[17]。

本研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素誘導(dǎo)的模型組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化，血清ALT、AST活性與空白對照組比較均顯著升高，提示雷公藤甲素誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型建立成功；而給予不同劑量甘草水提物干預(yù)后，大鼠肝組織病理學(xué)變化程度減輕，血清ALT、AST活性與模型組比較顯著降低，提示甘草水提物能減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。Western blotting法檢測結(jié)果顯示，雷公藤甲素可致大鼠肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較顯著升高、IL-10蛋白表達(dá)水平顯著降低；而給予不同劑量的甘草水提物干預(yù)后，大鼠肝組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平與模型組比較顯著降低、IL-10蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明甘草水提物能下調(diào)雷公藤甲素致肝損傷模型大鼠肝組織中促炎因子的表達(dá)、上調(diào)抗炎因子的表達(dá)。

綜上所述，甘草水提物可能通過下調(diào)雷公藤甲素致肝損傷模型大鼠肝組織中TNF-α表達(dá)、上調(diào)IL-10表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體抗炎、促炎作用間的平衡，進(jìn)而減輕大鼠肝細(xì)胞損傷，起到保肝作用。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 高曉娟，趙丹，趙建軍，等.甘草的本草考證[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（2）：193-198.

[ 2 ] SHUAI J，LI Z，WEI S，et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis（Licorice）：discovery of the effective components of a traditional herbal medicine[J]. J Nat Prod，2016，79（2）：281-292.

[ 3 ] KONG LL，ZHUANG XM，YANG HY，et al. Inhibition of P-glycoprotein gene expression and function enhances triptolide-induced hepatotoxicity in mice[J]. Sci Rep，2015.DOI：10.1038/srep11747.

[ 4 ] LI J，SHEN F，GUAN C，et al. Activation of Nrf2 protects against triptolide-induced hepatotoxicity[J]. PLoS One，2014，9（7）：e100685.

[ 5 ] LIU X，LIU Y，CHENG M，et al. Metabolomic responses of human hepatocytes to emodin，aristolochic acid，and triptolide：chemicals purified from traditional Chinese medicines[J]. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（11）：533- 543.

[ 6 ] TAN QY，HU Q，ZHU SN，et al. Licorice root extract and magnesium isoglycyrrhizinate protect against triptolide-induced hepatotoxicity via up-regulation of the Nrf2 pathway[J]. Drug Deliv，2018，25（1）：1213-1223.

[ 7 ] LU Y，XIE T，ZHANG Y，et al. Triptolide induces hepatotoxicity via inhibition of CYP450s in rat liver microsomes[J]. BMC Complement Altern Med，2017，17（1）：15-30.

[ 8 ] ZHANG H，YA G，Rui H. Inhibitory effects of triptolide on human liver cytochrome P450 enzymes and P-glycoprotein[J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2016，42（1）：89-98.

[ 9 ] 趙小梅，宮嫚，董捷鳴，等.甘草炮制雷公藤降低其肝毒性作用的初步研究[J].中國中藥雜志，2017，42（1）：119- 124.

[10] TAI T，HUANG X，SU Y，et al. Glycyrrhizin accelerates the metabolism of triptolide through induction of CYP3A in rats[J]. J Ethnopharmacol，2014，152（2）：358-363.

[11] 陳鑫，葛芹，張彩云，等.異甘草酸鎂對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白及其mRNA表達(dá)的影響[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，36（1）：55-58.

[12] HERMENEAN A，MARIASIU T，NAVARRO-GONZáLEZ I，et al. Hepatoprotective activity of chrysin is mediated through TNF-α in chemically-induced acute liver damage：an in vivo study and molecular modeling[J]. Exp Ther Med，2017，13（5）：1671-1680.

[13] ILAN Y，GINGIS-VELITSKI S，BEN YA，et al. A plant cell-expressed recombinant anti-TNF fusion protein is biologically active in the gut and alleviates immune-mediated hepatitis and colitis[J]. Immunobiology，2017，222（3）：544-551.

[14] 劉鑫，白梅榮.蒙藥紅花對急性肝損傷大鼠TNF-α表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，46（2）：116-119.

[15] LIU HM，HAN YZ，GUO YM，et al. The protection effects of Liuweiwuling tablets against concanavalin A-induced acute immunological liver injury in mice[J]. Chin Pharmacol Bull，2017，33（1）：133-140.

[16] WANG X，SUN L，ZHANG L，et al. Effect of adoptive transfer or depletion of regulatory T cells on triptolide-induced liver injury[J]. Front Pharmacol，2016. DOI：10.3389/fphar.2016.00099.

[17] 程鉥濼，言楓，顧一煌.電針足三里對雷公藤甲素致急性肝損傷大鼠IL-10與TNF-α的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2017，23（2）：245-246.

（收稿日期：2018-07-17 修回日期：2018-12-06）

（編輯：段思怡）