李盼 武才琪 王慶林

〔摘要〕 目的 分析日本鳶尾（Iris japonica）內(nèi)生真菌的類群分布。方法 通過菌落形態(tài)特征、顯微鏡下的孢子觀察及基于ITS序列分析的分子生物學(xué)鑒定分析日本鳶尾各部位內(nèi)生真菌的類群組成。結(jié)果 從日本鳶尾的根莖葉中共分離得到5種內(nèi)生真菌。根中分離得到的內(nèi)生真菌為橘青霉（Penicillium citrinum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），莖中為小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum），葉中為橘青霉（Penicillium citrinum）、肉色隔孢伏革菌（Peniophora incarnata）、首都葉點(diǎn)霉（Phyllosticta capitalensis）。結(jié)論 自日本鳶尾分離獲得5種內(nèi)生真菌，其分布具有一定的組織特異性，可為藥用植物內(nèi)生真菌的開發(fā)和利用提供一定基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 日本鳶尾;內(nèi)生真菌;分離;鑒定

〔中圖分類號〕R284;R372? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.011

內(nèi)生真菌是指一類生活在植物組織內(nèi)部而不使宿主植物產(chǎn)生明顯病害癥狀的真菌[1-2]。植物內(nèi)生真菌以其豐富的多樣性和復(fù)雜性，作為微生物資源寶庫之一，具有巨大的潛能，而且具有生物活性化合物的比例明顯比土壤來源的微生物高[3]，因此，植物內(nèi)生真菌的分離、鑒定、生物活性物質(zhì)、次級代謝產(chǎn)物活性的研究近年來已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[4-7]。日本鳶尾（Iris japonica Thunb）是天門冬目鳶尾科的草本植物，又名蝴蝶花、白花射干，原產(chǎn)地是中國、日本和韓國，其性寒、味苦，具有清熱解毒、消痰、利咽的功能，在臨床上對治療咽喉炎有很好的療效，特別用于治療喉頭痙攣水腫效果尤好，此外，與其他中藥配伍對感冒、氣管炎、慢性胃炎、肝炎都有一定療效，因此，該植物具有較好的應(yīng)用前景[8]。目前對日本鳶尾中的內(nèi)生真菌研究尚未見報(bào)道。通過選擇健康的日本鳶尾植物組織作為內(nèi)生真菌分離的材料，對日本鳶尾的根、莖、葉等部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)的分離和類群鑒定分析，以期不斷地豐富內(nèi)生真菌資源，為開發(fā)利用藥用植物內(nèi)生真菌提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品采集? 日本鳶尾采自湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院院內(nèi)中藥園，經(jīng)本院藥用植物教研室趙冰清教授鑒定后，采集其根、莖、葉，將樣本存放在冰盒中運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室中，保證其處于低溫干燥的環(huán)境中。5 h內(nèi)對采集樣本進(jìn)行處理，進(jìn)行內(nèi)生真菌的初步分離[9]。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.1.3? 主要儀器與設(shè)備? BSG-4生物安全柜（造鑫企業(yè)有限公司）;SHP-250生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;LD2X-50FA立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）;101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;ZD-85氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）;SIGMA 3K3OH冷凍高速離心機(jī)（德國SIGMA公司）;G：BOXF3電泳凝膠成像分析儀（基因有限公司）;ABI2720 PCR儀（美國ABI公司）;超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）;國之源純水器（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）;瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）;普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.1.4? 試劑? HP真菌DNA小量抽提試劑盒（OMEGA公司）;核酸染色劑（北京索萊寶科技有限公司）;RNase A（MP生物醫(yī)學(xué)公司）;2×Taq預(yù)混PCR反應(yīng)體系（北京康潤生物科技有限公司）;瓊脂糖（BioFroxx公司）;5×TBE、通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（上海生工生物工程公司）;500 bpDNA Ladder（天根生化科技有限公司）;分析純次氯酸鈉、無水乙醇、β-巰基乙醇、三氯甲烷、異丙醇（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 日本鳶尾內(nèi)生真菌的分離? 日本鳶尾的根、莖、葉先用自來水洗去表面泥漬，最后用無菌水沖洗一遍，再放入培養(yǎng)皿內(nèi)鋪平晾干后在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒[10]：75%乙醇1 min、次氯酸鈉溶液（3%～5%有效氯）3 min、75%乙醇0.5 min，后用無菌水沖洗4遍，采用兩種對照試驗(yàn)來進(jìn)行消毒效果檢測[11-12]：一是漂洗液檢測法，把最后一遍沖洗水涂布在PDA培養(yǎng)基上，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;二是組織印跡法，將已經(jīng)滅菌的根莖葉分別壓入PDA培養(yǎng)基中，使樣品與培養(yǎng)基緊密接觸20 min，接著移去滅菌植物樣品，將培養(yǎng)基同樣放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。對消毒好的樣品晾干，在超凈工作臺中用無菌剪刀將根莖葉分別剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的小組織塊，均勻的平鋪在PDA平板中，同時(shí)做好標(biāo)記，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2周，待菌落長出后根據(jù)菌落特征的不同再來進(jìn)行分離，最后將完全純化的內(nèi)生真菌保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2? 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定? 通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，參照相關(guān)真菌書籍對分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定[13-14]：主要從菌落的大小、顏色、質(zhì)地等肉眼特征和孢子的顏色、形狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型、孢子大小等顯微特征進(jìn)行初步判斷和分類。

1.2.3? 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定 將分離培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌接種到含有50 mL PDB的錐形瓶中，每種接種4瓶。26 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)2～7 d，待其發(fā)酵渾濁后離心取其沉淀，將沉淀放入50 ℃烘箱中過夜干燥備用。稱取10～50 mg的干燥沉淀至事先已滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管。按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取真菌DNA。將所提DNA放置于-20 ℃條件下備用。利用真菌ITS1與ITS4通用引物（委托上海生工生物工程公司合成）對提取的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]，反應(yīng)體系20 μL∶7 μL ddH2O、10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye、1 μL正向引物、1 μL反向引物、1 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，3 min;變性94 ℃，30 s;退火55 ℃，30 s;延伸72 ℃，1 min。共30個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下500 bp處有明顯條帶出現(xiàn)。最后委托湖南省擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序后將真菌ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（http：//blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）比對，來獲得所提內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定信息。

2 結(jié)果

2.1? 消毒效果的檢測

把最后一遍沖洗水涂布在PDA培養(yǎng)基上，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，無菌落長出。同時(shí)將已經(jīng)滅菌的根莖葉壓入PDA培養(yǎng)基中，使樣品與培養(yǎng)基緊密接觸20 min，移去滅菌植物樣品，同樣放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d也未觀察到真菌生長。以上結(jié)果充分證明，經(jīng)過嚴(yán)格的表面消毒程序后，附著在植物表面的菌類已經(jīng)被徹底消除，分離得到的菌株來自于植物體內(nèi)部，屬于內(nèi)生真菌。

2.2? 日本鳶尾內(nèi)生真菌的分布和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

從日本鳶尾的根、莖、葉中共分離純化出5種20株內(nèi)生真菌，分別為橘青霉、尖孢鐮刀菌、肉色隔孢伏革菌、首都葉點(diǎn)酶（有性形為球座菌屬（Guignardia））和小新殼梭孢菌。菌落特征和顯微特征描述見表1，分子鑒定結(jié)果見表2。通過基于測序結(jié)果將內(nèi)生真菌ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對后，收集同源性比較高的比對序列，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其同源性分別是：R1為100%;R2為100%;R3為84%，R4為87%;R5為64%。R1代表根4B和葉1D2的ITS序列，R2代表根2D和根5B的的ITS序列，R3代表葉2A1的ITS序列，R4代表莖2E的ITS序列，R5代表葉2A2的ITS序列。結(jié)果表明其同源性都大于50%，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹原理[16]，ITS同源性支持形態(tài)學(xué)上R1、R2、R3、R4和R5菌株分別鑒定為橘青霉、尖孢鐮刀菌、肉色隔孢伏革菌、小新殼梭孢菌和首都葉點(diǎn)酶。因?yàn)橹参飪?nèi)生真菌在培養(yǎng)過程中受外在條件的影響易發(fā)生變異，因此，需綜合考慮來對其進(jìn)行分類鑒定。

3 討論

通過形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定方法的研究表明：日本鳶尾的根、莖、葉中都存在一定量的內(nèi)生真菌，并且在植物的組織部位上及內(nèi)生真菌的屬別上均體現(xiàn)出一定的專一性，這可能是由于內(nèi)生真菌受宿主植物不同組織部位微環(huán)境差異的影響，如光照強(qiáng)度、濕度、氣溫變化等的影響[17]，同時(shí)不同組織中也含有共同的菌群，表明內(nèi)生真菌在組織分布上既具有差異性又具有共同性。研究表明內(nèi)生真菌自身也能產(chǎn)生各種類型的生物活性物質(zhì)，而且很多內(nèi)生真菌可能也帶有植物體的酶系，具有與宿主相同或類似生理活性的次級代謝產(chǎn)物，與宿主長期地共同進(jìn)化并產(chǎn)生協(xié)同作用[18]。姚裕群等人對越南槐中內(nèi)生真菌的多樣性、抑菌活性及其次生代謝產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn)其抗菌資源豐富，多個(gè)菌株顯示了與宿主相似的強(qiáng)抑菌活性，對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等人體病原菌具有明顯的抑制作用[6]，有學(xué)者從藥用植物鴉膽子的根、莖、葉和果實(shí)中共分離出83株內(nèi)生真菌，且擬莖點(diǎn)霉屬中的菌株YJ-17對靶向微生物具有較好的抑制作用[7]。今后我們將進(jìn)一步開展日本鳶尾內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] STIERLE A， STROBEL G， STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae， an? Endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.

[2] BEZERRA J D P， NASCIMENTO C C F， BARBOSA R D N，et al. Endophytic fungi from medicinal plant Bauhinia forficate：Diversity and biotechnological potential[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2015，46（1）：49-57.

[3] STROBEL G A. Endophytes as sources of bioactive products[J]. Microbes and infection， 2003， 5（6）：535-544.

[4] 王志偉，紀(jì)燕玲，陳永敢.植物內(nèi)生真菌研究及其科學(xué)意義[J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（2）：349-363.

[5] 古海剛，白紅進(jìn)，曾艷波，等.中國紅樹植物角果木內(nèi)生真菌的分離及其初步鑒定[J].微生物學(xué)雜志，2012，32（6）：1-6.

[6] 姚裕群，越南槐內(nèi)生真菌多樣性、抑菌活性及其次生代謝產(chǎn)物研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2017.

[7] LIANG Z N， ZHU H， LAI K P， et al. Isolation of endophytic fungi from medicinal plant Bruea javanica and their microbial inhibition activity[J]. Journal of Chinese Medicinal materials， 2014，37（4）：564-658.

[8] 黃康泰.現(xiàn)代本草綱目[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001.

[9] 劉兆迪，解修超，陳文強(qiáng)，等.藥用植物三尖杉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（9）：128-132.

[10] 王利娟，賀新生.植物內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)的研究方法[J].微生物學(xué)雜志，2006（4）：55-60.

[11] 李? 軍，李? 白，高廣春.藥用植物內(nèi)生菌抑菌作用研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（11）：1989-1992.

[12] 羅利瓊，謝華榮，鄧祖軍，等.蚌花內(nèi)生真菌類群分布及抗菌、抗腫瘤活性的初篩[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，32（6）：683-689.

[13] 戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類[M].北京：科學(xué)出版社，1987.

[14] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982.

[15] 郭順星.藥用植物內(nèi)生真菌生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2016.

[16] 黃琪佳，吳? 敏，黃玉瑩，等.鳶尾內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum YW1的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，50（6）：880-885.

[17] 胡克興，侯曉強(qiáng)，郭順星.鐵皮石斛內(nèi)生真菌分布[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（1）：37-42.

[18] TAN R X， ZOU W X. Endophytes： a rich source of functional metabolites[J]. Natural Product Reports， 2001，18（4）：448-459.