溫子帥 李新蕊 木盼盼 宋軍娜 張彥昭 鄭玉光 嚴(yán)玉平 馬東來

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2802-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.13

摘 要 目的：建立同時測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A含量的方法，并進(jìn)行質(zhì)量等級劃分。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定含量。色譜柱為Inertsil ODS-SP，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.9 L/min，進(jìn)樣體積為20 μL。以藥材樣品厚度、寬度、長度、百粒質(zhì)量為指標(biāo)，考察其外觀性狀;采用SPSS 22.0軟件分析樣品中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A含量及其外觀性狀與中藥質(zhì)量常數(shù)的相關(guān)性，并建立該藥材的質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.03～6.18 μg/mL（r=0.999 7）、1.05～6.30 μg/mL（r=0.999 8）;定量限分別為0.171、0.174 μg/mL，檢測限分別為0.052、0.053 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為99.01%～102.97%（RSD=1.39%，n=6）、97.94%～101.03%（RSD=1.13%，n=6）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藥材長度、寬度、百粒質(zhì)量、斯皮諾素含量、酸棗仁皂苷A含量均與其中藥質(zhì)量常數(shù)呈正相關(guān)。質(zhì)量等級劃分結(jié)果顯示，30批樣品中S1～S4、S7～S12為一等品;S5、S6、S13～S17、S20～S30為二等品;S18、S19為三等品。結(jié)論：所建含量測定方法操作簡單，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均較好，可用于同時測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的含量;所建酸棗仁質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)可用于綜合評價該藥材質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 酸棗仁;斯皮諾素;酸棗仁皂苷A;高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法;含量測定;中藥質(zhì)量常數(shù);質(zhì)量等級

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of spinosin and jujuboside A in the seads of Ziziphus jujuba， and to investigate its quality grading standard. METHODS： HPLC-ELSD method was adopted. The separation was carried out on Inertsil ODS-SP column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， the temperature of drift tube was 90 ℃， the flow of carrier gas was 2.9 L/min and injection volume was 20 μL. The thickness， width， length and 100-grain quality of the medicinal materials were used as indicators to investigate the appearance traits. SPSS 22.0 software was used to analyze the correlation of the contents of spinosin and jujuboside A， its appearance traits with the quality constant of TCM， and establish a quality classification standard for the seads of Z. jujuba. RESULTS： The linear range of spinosin and jujuboside A were 1.03-6.18 μg/mL （r=0.999 7）， 1.05-6.30 μg/mL （r=0.999 8）; the limits of quantitation were 0.171， 0.174 μg/mL， respectively; the limits of detection were 0.052， 0.053 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower 2%. The recoveries were 99.01%-102.97% （RSD=1.39%， n=6）， 97.94%-101.03% （RSD=1.13%， n=6）， respectively. Correlation analysis results showed that the length， width， 100-grain quality spinosin content and jujuboside A content of the medicinal materials were positively correlated with the quality constant of TCM. The results of quality classification for 30 batches of medicinal materials showed that S1-S4 and S7-S12 were first-class products; S5， S6， S13-S17 and S20-S30 were second-class products; S18 and S19 were third-class products. CONCLUSIONS： Established content determination method is simple， precision， accurate and stable， and can be used for simultaneous determination of spinosin and jujuboside A in the seads of Z. jujuba. Established quality grading standard of the seads of Z. jujuba can be used to evaluate the quality.

KEYWORDS? ?The seads of Ziziphus jujuba; Spinosin， Jujuboside A; HPLC-ELSD; Content determination; Quality constant; Quality level

酸棗仁為鼠李科植物酸棗[Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa（Bunge） Hu ex H. F. Chou]的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味甘、酸，性平，歸肝、膽、心經(jīng)，具有寧心安神、養(yǎng)心補(bǔ)肝、斂汗、生津的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁具有降血壓、抗焦慮、抗心肌缺血、治療神經(jīng)衰弱等作用[2]，為中醫(yī)臨床常用藥，主產(chǎn)于河北、山東、遼寧、陜西等地[3]。酸棗仁為臨床治療失眠的常用藥之一，其有效成分斯皮諾素和酸棗仁皂苷A是其發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠作用的主要成分，目前現(xiàn)已上市的成藥制劑有棗仁安神膠囊、復(fù)方酸棗仁軟膠囊等，且在治療失眠、抑郁等疾病方面已取得顯著療效[4-5]。隨著人們生活節(jié)奏的加快，失眠發(fā)生率近年來有所增加，臨床對酸棗仁的需求量也隨之增加，故其質(zhì)量的優(yōu)劣備受關(guān)注，目前有部分產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了嚴(yán)重的“搶青”現(xiàn)象，導(dǎo)致酸棗仁不飽滿、質(zhì)量不合格[6]，因此其等級劃分對于規(guī)范市場、方便企業(yè)選擇優(yōu)良品種具有重要意義。

中藥材規(guī)格等級劃分標(biāo)準(zhǔn)是規(guī)范市場流通藥材質(zhì)量的重要參考方法。雖然國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合衛(wèi)生部早在1984年就頒布了《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)定了酸棗仁的等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[7]，但該標(biāo)準(zhǔn)僅從酸棗仁的外觀、顏色、霉變情況、蟲蛀、色澤、飽滿度、含雜率等方面進(jìn)行區(qū)分，難以全面反映酸棗仁質(zhì)量與等級的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥質(zhì)量常數(shù)可以有效地與中藥材的外觀性狀、有效成分相結(jié)合，成為客觀合理的等級劃分依據(jù)[8-9]?；诖?，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[1，10]，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法同時測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的含量，通過分析中藥質(zhì)量常數(shù)與酸棗仁外觀性狀、有效成分含量的相關(guān)性，建立了酸棗仁的質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，旨在為其等級劃分標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G4260B型蒸發(fā)光檢測器、G7111A型四元梯度泵、G7129A型自動進(jìn)樣器、OpenLAB CDS 2.3色譜工作站（美國Agilent公司）;SQP型萬分之一電子天平、ME204E型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

斯皮諾素對照品（批號：Y25O9H73433，純度：≥98%）、酸棗仁皂苷A對照品（批號：P13J9S65562，純度：≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;乙腈為色譜純，甲醇、石油醚均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

30批酸棗仁藥材樣品，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院嚴(yán)玉平教授鑒定為鼠李科植物酸棗[Z. jujuba Mill. var. spinosa（Bunge） Hu ex H. F. Chou]的干燥成熟種子。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，15%A→25%A;5～20 min，25%A→30%A;20～25 min，30%A→50%A;25～35 min，50%A→55%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;漂移管溫度：90 ℃;載氣流速：2.9? L/min;進(jìn)樣體積：20 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取斯皮諾素對照品1.03 mg、酸棗仁皂苷A對照品1.05 mg，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成含斯皮諾素、酸棗仁皂苷A質(zhì)量濃度分別為0.206、0.210 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取酸棗仁粉末（過四號篩）1.0 g，置于索氏提取器中，加石油醚適量，加熱回流4 h，濾過至干，得脫脂后的藥材粉末。取上述藥材粉末適量，加70%乙醇溶液20 mL，加熱回流2 h，濾過并回收溶劑至干;殘渣置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 空白對照溶液的制備 以甲醇為空白對照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照品溶液各20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定進(jìn)樣，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，空白對照溶液在混合對照品色譜峰相應(yīng)位置處無色譜峰出現(xiàn)，空白對照無干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得斯皮諾素回歸方程為y=281.45x+172.19（r=0.999 7），酸棗仁皂苷A回歸方程為y=449.12x-270.25（r=0.999 8）。結(jié)果表明，斯皮諾素、酸棗仁皂苷A分別在1.03～6.18、1.05～6.30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 定量限與檢測限考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，用乙腈倍比稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的定量限分別為0.171、0.174 μg/mL，檢測限分別為0.052、0.053 μg/mL。

2.1.8 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，斯皮諾素、酸棗仁皂苷A峰面積的RSD 分別為1.03%、1.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，斯皮諾素、酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為1.51%、0.83%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材粉末（編號：S1）1.0 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的含量。結(jié)果，斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的平均含量分別為0.098%、0.097%，RSD分別為1.07%、0.96%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗 精密稱取藥材粉末（編號：S1）1.0 g，共6份，加入一定量的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.12 樣品含量測定 精密稱取各批藥材樣品，每份1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量，結(jié)果見表3。

2.2 外觀性狀

以藥材樣品厚度、寬度、長度、百粒質(zhì)量（由于種子類中藥材體積較小，故測定100粒樣品的質(zhì)量，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性）為指標(biāo)，考察酸棗仁的外觀性狀。分別從各批樣品中隨機(jī)抽取100粒酸棗仁，采用游標(biāo)卡尺分別測量厚度、寬度、長度，平行操作3次，取其平均值;采用萬分之一電子天平測定百粒質(zhì)量，平行操作3次，取其平均值，結(jié)果見表4。

2.3 酸棗仁質(zhì)量常數(shù)

中藥質(zhì)量常數(shù)是集中藥材形態(tài)參數(shù)和有效成分含量于一體的用于綜合評價中藥材等級的方法，質(zhì)量常數(shù)越大表示等級越高、質(zhì)量越好[11]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]建立了酸棗仁形狀模型（見圖2，其中a為長度，b為寬度，h為厚度，下同）及酸棗仁質(zhì)量常數(shù)（A）的計算公式：

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 酸棗仁有效成分質(zhì)量常數(shù)與外觀性狀、含量的相關(guān)性 采用SPSS 22.0軟件分別對酸棗仁斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的質(zhì)量常數(shù)與其外觀性狀、含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表6。

由表6可知，酸棗仁的厚度、寬度、長度、百粒質(zhì)量、有效成分含量與其質(zhì)量常數(shù)的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各指標(biāo)與有效成分質(zhì)量常數(shù)相關(guān)性大小的順序為有效成分含量>寬度>長度>百粒質(zhì)量>厚度，且均與其質(zhì)量常數(shù)呈正相關(guān)（厚度的相關(guān)性不大可忽略），即酸棗仁有效成分含量越高、寬度越寬、長度越長、百粒質(zhì)量越重，其有效成分的質(zhì)量常數(shù)越大。

2.4.2 酸棗仁相對質(zhì)量常數(shù)與外觀性狀、有效成分相對質(zhì)量常數(shù)的相關(guān)性 采用SPSS 22.0軟件對酸棗仁相對質(zhì)量常數(shù)與其外觀性狀、有效成分相對質(zhì)量常數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表7。

由表7可知，酸棗仁的厚度、寬度、長度、百粒質(zhì)量、斯皮諾素相對質(zhì)量常數(shù)、酸棗仁皂苷A相對質(zhì)量常數(shù)與其相對質(zhì)量常數(shù)的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各指標(biāo)與酸棗仁相對質(zhì)量常數(shù)相關(guān)性大小的順序為酸棗仁皂苷A相對質(zhì)量常數(shù)>寬度>長度>斯皮諾素相對質(zhì)量常數(shù)>百粒質(zhì)量>厚度，且均與其相對質(zhì)量常數(shù)呈正相關(guān)（厚度的相關(guān)性不大可忽略），即酸棗仁皂苷A相對質(zhì)量常數(shù)越大、寬度越寬、長度越長、斯皮諾素相對質(zhì)量常數(shù)越大、百粒質(zhì)量越重，酸棗仁相對質(zhì)量常數(shù)越大。

2.5 質(zhì)量等級劃分

將30批酸棗仁樣品的百分質(zhì)量常數(shù)（A%）進(jìn)行排序（見表5），同時參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]建立酸棗仁的質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)：A%≥80%為一等，>50%～<80%為二等，≤50%為三等。結(jié)果，30批樣品中S1～S4、S7～S12為一等品;S5、S6、S13～S17、S20～S30為二等品;S18、S19為三等品。各等級樣品的典型外觀特征見圖3。

3 討論

《中國藥典》[14-15]、《中華本草》[16]、《500味常用中藥材的經(jīng)驗鑒別》[17]、《現(xiàn)代中藥材商品通鑒》[18]、《中藥大辭典》[19]、《金世元中藥材傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗》[20]等典籍均記載酸棗仁以粒大飽滿，外皮色紫紅、光滑油潤，種仁色黃白者為佳，但均未結(jié)合其有效成分進(jìn)行綜合評價。同時，中藥材等級的劃分雖然與其質(zhì)量息息相關(guān)，但有效成分含量也不足以全面評價中藥材質(zhì)量[12]。因此，本研究采用HPLC-ELSD法同時測定酸棗仁中斯皮諾素和酸棗仁皂苷A的含量，并通過建立中藥質(zhì)量常數(shù)與其外觀性狀、有效成分含量的相關(guān)性，來綜合評價酸棗仁的質(zhì)量。

中藥質(zhì)量常數(shù)已成功應(yīng)用于多種類型中藥飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，如牡丹皮[11]、柴胡[12]、黃柏[13]等，這些藥材在建立形狀模型時可視其為圓柱體或長方體。由于酸棗仁為種子類藥材，外形似橢球體，故本研究參考上述文獻(xiàn)，建立了酸棗仁的橢球體形狀模型，通過中藥質(zhì)量常數(shù)將酸棗仁的外觀性狀與其有效成分含量相結(jié)合，可從數(shù)據(jù)上更加簡明直觀地反映藥材質(zhì)量的差異程度，還可在商品流通過程中有效避免通過主觀因素（外觀性狀）或含量等單一因素對中藥材質(zhì)量進(jìn)行判斷。該方法也適用于其他橢球體種子類藥材的等級劃分及質(zhì)量評價。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藥材樣品的長度、寬度及斯皮諾素含量、酸棗仁皂苷A含量均與其質(zhì)量常數(shù)呈正相關(guān);厚度相關(guān)性不大，其原因可能為種子類藥材存在“搶青”現(xiàn)象，從而導(dǎo)致種子外觀呈現(xiàn)飽滿而內(nèi)部子葉、胚乳等結(jié)構(gòu)萎縮消失的情況，因此種子的厚度并不能代表其飽滿度[21]。

等級劃分結(jié)果顯示，30批樣品中S1～S4、S7～S12為一等品，S5、S6、S13～S17、S20～S30為二等品，S18、S19為三等品。該結(jié)果與市售商標(biāo)等級存在差異，其原因可能為酸棗仁的產(chǎn)地不同，其劃分標(biāo)準(zhǔn)不一，導(dǎo)致酸棗仁質(zhì)量等級劃分結(jié)果不同。

綜上所述，本研究所建含量測定方法操作簡單，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均較好，可用于同時測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A的含量;酸棗仁長度越長、寬度越寬、百粒質(zhì)量越重、斯皮諾素和酸棗仁皂苷A含量越高，其質(zhì)量越好。本研究所建酸棗仁質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)可用于綜合評價該藥材質(zhì)量。

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[20] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：3577.

[21] 武延生.搶青對酸棗生物量積累的變化研究[J].北方園藝，2013（6）：31-32.

（收稿日期：2019-05-08 修回日期：2019-08-22）

（編輯：陳 宏）