陳頔 唐艷斌 樸瑋 王鷗 黃建 王麗娟

摘 要：目的：研究靈芝子實體濃縮膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用。方法：將50只健康的雌性昆明小鼠隨機分成空白對照組、模型對照組、靈芝子實體濃縮膠囊低（83.5mg/kg·BW）、中（167mg/kg·BW）、高劑量組（500mg/kg·BW），每組10只。每日灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃給藥37d，空白對照組和模型對照組按等量蒸餾水灌胃。給予受試物第37天，模型對照組及受試物各劑量組灌胃給予50%乙醇（13mL/kg·BW）造成急性肝損傷模型，禁食16h處死動物，測定各組小鼠肝組織中丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）、還原型谷胱甘肽（GSH）的含量并觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：各劑量組間小鼠與模型對照組相比，靈芝子實體濃縮膠囊高劑量組的MDA、TG含量明顯低于模型對照組，差異具有顯著性（P<0.05），中、高劑量組的GSH含量顯著高于模型對照組，差異具有顯著性（P<0.01）。靈芝子實體濃縮膠囊能顯著改善肝細胞腫脹、壞死和炎性浸潤狀況，在脂肪變性方面各劑量組雖未發(fā)現(xiàn)顯著性改善，但與模型對照組比較，存在緩解肝損傷的趨勢。結(jié)論：靈芝子實體濃縮膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的輔助保護功能。

關(guān)鍵詞：靈芝子實體濃縮膠囊;酒精性肝損傷;保護作用;還原型谷胱甘肽;丙二醛;甘油三酯

根據(jù)目前人群對保肝護肝功能性產(chǎn)品的需求和現(xiàn)狀，探尋和篩選到抗急性酒精性肝損傷的保健品日益受到重視[1-6]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，靈芝在抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、鎮(zhèn)靜安神、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血脂等方面均有較好的療效[9]。靈芝中的最主要活性成分包括靈芝多糖和三萜，但對靈芝子實體這一復(fù)合體的功能研究目前偏少，本實驗主要以急性酒精性肝損傷為模型，從而進一步闡明靈芝子實體濃縮膠囊對肝損傷小鼠的輔助保護功能。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

靈芝子實體濃縮膠囊，由醇提靈芝提取物、淀粉和硬脂酸鎂為原輔料制成，標(biāo)志性成分為總?cè)坪挽`芝多糖。靈芝子實體原料總?cè)频暮堪凑铡侗＝∈称饭πС煞謾z測方法》（2011版）中“總?cè)频姆止夤舛葴y定法”進行測定和計算;靈芝多糖含量的測定則參照《中華人民共和國藥點》（2015版）一部中的“靈芝”項下的方法進行。經(jīng)測定，靈芝子實體原料每100g中，總?cè)频暮?.5g，以無水葡萄糖計靈芝多糖的含量為每100g8.0g。

1.2 實驗動物

健康清潔級雌性昆明小鼠，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，體重18～22g，共計50只。許可證號為SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)地點為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物房，級別：屏障環(huán)境，動物房使用許可證號：SYXK（京）2013-0019。各組小鼠均給予正?；A(chǔ)飼料，自由進食和飲水。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要儀器 電子天平、離心機、Gene5全自動多功能酶標(biāo)儀、加樣器、恒溫水浴鍋、混旋器、組織勻漿器、脫水機、包埋機、石蠟切片機、染色機、封片機、顯微鏡。

1.3.2 主要試劑 無水乙醇（新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司，批號20150905）、甲醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20151207）、0.9%氯化鈉溶液（石家莊四藥有限公司，批號1609053201）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號20170528）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號20170526）、甘油三酯（TG）測定試劑盒（南京建成科技有限公司，批號20170526）。

1.4 方法

1.4.1 受試樣品劑量的確定 《中華人民共和國藥點》（2015版）一部的“靈芝”中，靈芝生藥飲片的用量為6～12g，按每天平均用量10g生藥飲片進行計算，本研究選用經(jīng)過加工處理好的靈芝子實體濃縮膠囊內(nèi)容物進行實驗，經(jīng)過綜合考慮和膠囊工藝制備的情況，最后選用濃縮倍數(shù)相當(dāng)?shù)臈l件，即確定人體對該濃縮膠囊的推薦攝入量為1g/d。

1.4.2 動物實驗分組 健康昆明種雌性小鼠50只，按體重隨機分成5組，每組10只，靈芝子實體濃縮膠囊按成人60kg體重計，受試物推薦劑量相當(dāng)于每人每日16.7mg/kg。實驗設(shè)計按人體推薦量的5、10、30倍，即每日83.5、167、500mg/kg·BW為低、中、高劑量組。同時設(shè)空白對照組和模型對照組。

1.4.3 動物實驗方法 實驗方法按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）中對化學(xué)性肝損傷有輔助保護作用檢驗方法中酒精肝損傷模型進行。動物適應(yīng)飼養(yǎng)4d后，各劑量組灌胃給予受試物，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，灌胃量10mL /kg·BW，連續(xù)37d，每天1次。動物每周稱重2次，按體重調(diào)整灌胃量。給予受試物第37天，模型對照組及受試物各劑量組灌胃給予50%乙醇，灌胃量為13mL/kg·BW，造成急性酒精性肝損傷模型，空白對照組給予蒸餾水，禁食16h處死動物，剖取小鼠肝臟左葉用10%甲醛固定，在肝組織中部做橫切面取材，-20℃恒冷低溫條件下切片（厚6μm），光鏡下做病理組織學(xué)檢查;另取肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，檢測肝組織中MDA、TG、GSH的含量。乙醇中毒小鼠肝臟病理組織學(xué)變化與評分標(biāo)準為：對每張病理切片全面進行觀察（不得遺漏任何視野），觀察脂肪滴在肝臟的分布、范圍和面積，分別記錄每個視野中的各種病變所占據(jù)視野的面積，累計所觀察視野的病變總分，并根據(jù)脂肪改變程度進行量化，按“-（0分）、+（1分）、++（2分）、+++（3分）、++++（4分）”;量化積分：肝細胞內(nèi)脂滴散在、稀少，0分;含脂滴的肝細胞不超過1/4，1分;含脂滴的肝細胞不超過1/2，且超過1/4，2分;含脂滴的肝細胞不超過3/4，且超過1/2，3分;肝組織幾乎被脂滴替代，4分。肝臟炎性細胞浸潤、細胞腫脹和壞死程度的量化和積分標(biāo)準同脂肪變性相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 717.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各劑量組與模型對照組比較采用方差分析，用多個實驗組和1個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計，對方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。模型對照組與空白對照組比較采用t檢驗。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。

1.6 結(jié)果判定

肝臟MDA、TG和還原型GSH三項檢測指標(biāo)結(jié)果陽性，或肝臟MDA、TG和還原型GSH三項指標(biāo)中任兩項指標(biāo)陽性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果陽性，即可判定受試樣品對化學(xué)性肝損傷有輔助保護功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝子實體濃縮膠囊對小鼠體重的影響

由表1可知，小鼠各劑量組及模型對照組動物初始體重和終體重與空白對照組動物體重比較，差異均無顯著性（P>0.05），表明靈芝子實體濃縮膠囊在本實驗條件下對小鼠的體重?zé)o明顯影響。

2.2 靈芝子實體濃縮膠囊對動物肝組織中MDA的影響

由表2可見，與空白對照組比較，模型對照組的MDA明顯高于空白對照組，差異具有顯著性（P<0.01），說明乙醇引起了小鼠組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。靈芝子實體濃縮膠囊低、中、高劑量組小鼠肝臟的MDA含量有所降低并呈一定的劑量關(guān)系，其中，與模型組比較，靈芝子實體濃縮膠囊500mg/kg·BW劑量組的MDA明顯低于模型對照組，差異具有顯著性（P<0.05），其他各劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，但MDA含量也逐漸減少。

2.3 靈芝子實體濃縮膠囊對動物肝組織中TG的影響

由表3可見，與空白對照組比較，模型對照組的TG明顯高于空白對照組，差異具有顯著性（P<0.01），說明乙醇所致急性肝損傷小鼠肝臟TG能力顯著降低。靈芝子實體濃縮膠囊500mg/kg·BW劑量組的TG與模型對照組比較，明顯低于模型對照組，差異具有顯著性（P<0.05）。

2.4 靈芝子實體濃縮膠囊對動物肝組織中還原型GSH的影響

由表4可見，與空白對照組比較，模型對照組的GSH明顯低于空白對照組，差異具有顯著性（P<0.05），說明急性酒精性肝損傷模型造模成功。靈芝子實體濃縮膠囊167、500mg/kg·BW劑量組的GSH明顯高于模型對照組，差異具有顯著性（P<0.01）。

2.5 靈芝子實體濃縮膠囊對肝組織病理檢查結(jié)果的影響

如附圖所示，對酒精性肝損傷小鼠的肝組織進行HE染色，進行組織形態(tài)學(xué)觀察。從肝臟外觀來看，空白對照組肝組織色澤鮮紅，肉眼未見明顯病變，模型組和各劑量給藥組肝組織表面色澤發(fā)黃，且肉眼可見組織紋理粗糙，但模型組病變最為明顯。病理切片結(jié)果顯示，空白對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞以中央靜脈周圍為中心成板狀排列，位于中央肝結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理變化。模型對照組小鼠視野內(nèi)幾乎所有肝細胞高度腫脹、界限不清，靜脈周圍部分區(qū)域炎性細胞浸潤，肝細胞脂肪變性明顯，且出現(xiàn)肝細胞灶性壞死，表明造模成功。靈芝子實體濃縮膠囊低、中、高劑量組肝組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)和肝細胞脂肪變性、炎性浸潤等情況，與模型對照組比較有所恢復(fù)，脂肪病變程度有所減輕，但顯著性并不明顯，而炎性細胞浸潤程度則高劑量組顯著優(yōu)于模型對照組（P<0.05），細胞腫脹方面，靈芝子實體濃縮膠囊各劑量組與模型對照組比較均有顯著性差異（P<0.05），高劑量組病變程度積分最低，細胞壞死程度除模型組出現(xiàn)個例壞死外，其他各劑量組均未觀察到明顯細胞壞死現(xiàn)象。由表5～8可見，在肝組織病理檢查中，與空白對照組比較，模型對照組的肝臟脂肪改變、炎性浸潤、細胞腫脹和壞死的程度明顯高于空白對照組，差異具有顯著性（P<0.05），說明急性酒精性肝損傷模型造模成功。靈芝子實體濃縮膠囊各劑量組的肝臟脂肪改變程度與模型對照組比較，脂肪變性存在減緩的趨勢，但差異無顯著性（P>0.05），炎性細胞浸潤程度以高劑量組與模型對照組比較差異具有顯著性（P<0.05），細胞腫脹和壞死程度各劑量組與模型組比較均存在顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

本研究中靈芝子實體濃縮膠囊為靈芝提取物，其主要成分為總?cè)坪挽`芝多糖，靈芝多糖的保健功能多集中于降血糖、降血脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等[11-17]，而靈芝總?cè)频墓πС煞謩t多體現(xiàn)于抗腫瘤、保肝、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性等作用[18]。本實驗主要從小鼠肝組織中MDA、TG和GSH三項指標(biāo)與肝組織病理的改變，進而觀察靈芝子實體濃縮膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷的影響，結(jié)果表明，模型組MDA、TG、GSH水平均與空白對照組有顯著性差異，表明造模成功。靈芝子實體濃縮膠囊明顯降低急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、TG的含量，提高肝組織中GSH水平，由此提示，靈芝子實體濃縮膠囊對急性酒精性肝損傷肝臟的保護作用可能與其增強機體自由基的清除能力，抑制自由基反應(yīng)，抗脂質(zhì)過氧化相關(guān)，這與賀國芳[19]、張?zhí)m蘭[16]、薛承斌等[20]對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用研究結(jié)果一致。肝臟病理組織形態(tài)學(xué)方面，結(jié)果表明，雖然統(tǒng)計結(jié)果脂肪變性指標(biāo)未表現(xiàn)出模型組與各劑量組的顯著性差異，但與模型組比較，各劑量組肝細胞脂肪變性程度有所緩解，脂肪病變程度減輕，積分降低，而炎性細胞浸潤程度則高劑量組對模型組顯著性改善，結(jié)合生化指標(biāo)分析，這與肝組織TG水平變化基本一致，此研究結(jié)果與喬靖怡等[21]在金絲桃苷對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用一文中的結(jié)果大致相同。該實驗結(jié)果表明，靈芝子實體膠囊對小鼠的急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與增強機體脂質(zhì)過氧化、清除和抑制機體自由基能力等因素相關(guān)，這與先前大量的調(diào)查研究結(jié)果保持一致，因此，靈芝子實體濃縮膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠具有一定的保肝作用?！?/p>

參考文獻

[1]張睿，等.疏肝健脾方對化學(xué)性肝損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2014，30（2）：140-143.

[2]呂紀華，等.乙肝清對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：253-256.

[3]曹國瓊，等.甘寶膠囊對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（1）：264-267.

[4]吳娜，蔡光明，何群.氧化應(yīng)激與肝損傷[J].世界華人消化雜志，2008，16（29）：3310-3315.

[5]戴玉成，曹云，周麗偉，等.中國靈芝學(xué)名之管見[J].菌物學(xué)報，2013，32（6）：947-952.

[6]游麗君，等.不同提取方法對靈芝多糖性質(zhì)的影響研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（6）：1207-1212.

[7]Zhao L Y，et al.Extraction，purification characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：783-789.

[8]Heleno S，Barros L，Martins A，et al.Fruiting body，spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal：A comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts[J].Food Research International，2012，46（1）：135-140.

[9]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].第2版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001：1-327.

[10]鄔升，鄭世華.酒精性肝病的研究進展[J].海南醫(yī)學(xué)，2013，24（9）：1326-1328.

[11]Kim SJ，Lee JW，Jung YS，et al.Ethanolinduced liver inju-ry and changes in sulfur amino acid metabolo mics in glu-tat hione perox idase and catalase doubleknockout mice[J].JH ePatol，2009，50（6）：1184-1191.

[12]Beier JI，Luy endyk JP，Guo L，et al.Fibrin accumulation plays a critical role in the sensitization to lipopolysaccha-ride induced liver injury caused by ethanol in mice[J].Hepatology，2009，49（5）：1545-1553.

[13]王文斌，舒慧，任平.丹參注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響[J].咸寧學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，26（4）：279-282.

[14]鄧源，班春林，武曉瓊.乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機制的研究進展[J].華北國防醫(yī)藥，2005，17（4）：242-244.

[15]楊明杰，周建嫦，黃俊明，等.酒精性肝病發(fā)生機制研究進展[J].中國公共衛(wèi)生，2003，19（3）：367-368.

[16]張?zhí)m蘭，等.桑椹提取物對小鼠急性肝損傷保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（15）：149-152.

[17]毛健，馬海樂.靈芝多糖的研究進展[J].食品科學(xué)，2010，31（1）：295-299.

[18]李曄，朱忠敏，姚渭溪，等.靈芝三萜類化合物的研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37（2）：165-171.

[19]賀國芳，丁伊玲，徐清霞，等.白及多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（18）：1658-1661.

[20]薛承斌，晏瓊，韓定獻.貞茯菌膠囊對酒精性肝損傷模型小鼠的保護作用[J].中國藥房，2014，25（43）：4043-4045.

[21]喬靖怡，汪保英，栗愈程，等.金絲桃苷對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2017，33（3）：30-33.