郭高平

摘 要：目的：鑒定千金子乙醇提取物化學(xué)組成，探究其抗氧化活性，篩選活性化合物。方法：基于超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-TOF-MS），數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和文獻(xiàn)比對(duì)等手段對(duì)其活性成分進(jìn)行分析;采用DPPH和ABTS自由基清除法、β-胡蘿卜素漂白法對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)。結(jié)果：共鑒定出17個(gè)化合物，包括青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荊子黃酮4個(gè)黃酮類(lèi)化合物，瑞香素和雙七葉內(nèi)酯2個(gè)香豆素類(lèi)化合物;千金子乙醇提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力遠(yuǎn)大于BHT;對(duì)β-胡蘿卜素的漂白作用弱于BHT。結(jié)論：千金子乙醇提取物中含有較豐富的水溶性黃酮類(lèi)化合物和香豆素類(lèi)化合物，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：千金子;超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜;活性成分;抗氧化活性

千金子（Euphorbia lathyris）為大戟科植物續(xù)隨子的干燥成熟種子[1]，廣泛分布于吉林、河南、浙江、四川等省[2]，其性溫，味辛，逐水消腫、破血消癥，用于治療水腫、痰飲、積滯脹滿、二便不通、血瘀經(jīng)閉，外治頑癬、疣贅[3]。目前對(duì)千金子的研究多限于其化學(xué)成分的分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分有二萜醇及其酯類(lèi)、甾醇、香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、脂肪油及少量其他化合物[4-7]。自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有害化合物，過(guò)量的自由基對(duì)機(jī)體有損傷效應(yīng)，與炎癥、腫瘤等疾病密切相關(guān)。千金子含有二萜醇、甾醇、香豆素類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，也應(yīng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[8-10]，但未見(jiàn)對(duì)其抗氧化活性的報(bào)道?；诖?，本文利用高分辨質(zhì)譜鑒定千金子中化學(xué)成分，采用DPPH[11-12]和ABTS自由基清除法[13]，以及β-胡蘿卜素漂白法[14-15]對(duì)千金子乙醇提取物抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，再篩選出抗氧化活性化合物，為千金子資源的綜合利用、深度開(kāi)發(fā)提供一定的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 千金子（河南禹州，中國(guó)）;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、β-胡蘿卜素（上海阿拉丁試劑公司，中國(guó)）;2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（上海阿拉丁試劑公司，中國(guó)）;亞油酸（上海阿拉丁試劑公司，中國(guó)）;維生素C（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）;過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）（成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)，中國(guó)）;其余試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class）、四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Xevo G2-S QTof Mass Spectrometer，Waters公司）、UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥材處理 600g干燥的千金子藥材粉碎，加入乙醇冷浸提取，浸泡12h后超聲30min，循環(huán)此操作3d，取上清液。重復(fù)5次合并上清液，減壓濃縮，得千金子粗提物總浸膏50g，放置于4℃的冰箱待用。

1.2.2 UPLC-MS條件

（1）色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）;流動(dòng)相：A，甲醇;B，0.1%（V/V）甲酸水溶液;梯度洗脫：0～3min，20%～80% A;4～11min，80%～90% A;12～15min，90%～40% A;15～17min，40%～20% A;進(jìn)樣量：3μL;流速：0.3mL/min;柱溫：45℃。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子分辨率模式;毛細(xì)管電壓：2.5kV;樣品錐孔電壓：40V;萃取錐孔電壓：50V;溫源：100℃;脫溶劑溫度：800℃;錐孔氣：50L/h;脫溶劑氣流速：800L/h。

1.3 千金子乙醇提取物的抗氧化活性研究

1.3.1 DPPH和ABTS自由基清除法

（1）參照Larrauri等[16]的方法，以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。配置質(zhì)量濃度分別為0.004、0.006、0.008、0.010、0.015、0.020、0.040、0.060、0.080mg/mL的千金子提取物乙醇溶液。各取2mL于10mL EP管，加入2mL濃度6.086×10-5mmol/L DPPH乙醇溶液為樣品組。對(duì)照組為2mL BHT溶液和2mL DPPH的混合溶液;各組溶液混合均勻后，避光反應(yīng)30min，無(wú)水乙醇調(diào)零，于517nm下測(cè)定對(duì)照組和樣品組的吸光度。自由基清除率計(jì)算公式為式（1）：

（2）參照Tovar-Barrios[17]和李培源等[13]的方法，將等體積7.4mmol/L ABTS水溶液與2.6mmol/L K2S2O8水溶液混合，避光放置16h，得到ABTS+溶液。使用前將ABTS+溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋成工作液（在734nm下吸光度為0.70±002）。分別移取0.010、0.020、0.030、0.040mg/mL的千金子乙醇提取物溶液各1mL于EP管中，加入4mL ABTS+溶液。在1、3、5、10min時(shí)測(cè)定其吸光值。ABTS+清除率（S）計(jì)算公式為式（2）：

1.3.2 β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn) 參照陳小強(qiáng)[14]和詹濟(jì)華等[15]的方法，對(duì)千金子乙醇提取物對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系的抑制效果進(jìn)行測(cè)定。將2.5mg β-胡蘿卜素溶于5mL氯仿中，加入0.25g亞油酸及4.0g吐溫?；旌暇鶆蚝?0℃水浴除去氯仿;加入50mL熱蒸餾水，超聲震蕩配置成反應(yīng)介質(zhì)溶液。以不加β-胡蘿卜素溶液為空白調(diào)零。對(duì)照組以0.2mL乙醇和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液，樣品組為0.2mL樣品液和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液，陽(yáng)性對(duì)照組為0.2mL BHT和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液。各組在50℃下孵育30min，于470nm處測(cè)定吸光度，每5min測(cè)定1次，直至對(duì)照組顏色完全消失?？寡趸钚杂?jì)算公式[18]為式（3）：

2 結(jié)果與分析

2.1 千金子提取物液質(zhì)聯(lián)用分析條件選擇

分別采用正、負(fù)離子模式對(duì)千金子提取物進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)流動(dòng)相、色譜條件的優(yōu)化得到最佳條件，在該條件下千金子提取物中的特征峰得到了良好分離，峰型較好（圖1）。

x2.2 化合物鑒定

經(jīng)UPLC-MS分析，共檢測(cè)到39個(gè)色譜峰，依據(jù)各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、文獻(xiàn)對(duì)照，確定了千金子乙醇提取物中的17個(gè)化合物。從表1可以看出，千金子中含青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷和蔓荊子黃酮4個(gè)黃酮類(lèi)化合物，瑞香素和七葉內(nèi)酯2個(gè)香豆素類(lèi)化合物。上述物質(zhì)具有一定的抗氧化活性[19-20]。

2.3 DPPH和ABTS清除自由基試驗(yàn)

如圖2a所示，隨著千金子乙醇提取物濃度的增加，DPPH清除率逐漸升高，當(dāng)濃度大于0.020mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)90%以上。通過(guò)描點(diǎn)法測(cè)得千金子乙醇提取物半數(shù)清除率IC50為0.012mg/mL，BHT的半數(shù)清除率為0.016mg/mL。表明千金子乙醇總提取物的活性優(yōu)于BHT。當(dāng)千金子提取物濃度從0.01mg/mL增加至0.04mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率從32%增加至95%以上（圖2b），而B(niǎo)HT對(duì)ABTS自由基的清除率從5%增加至42%（圖2c）。上述結(jié)果說(shuō)明在相同濃度下千金子提取物抗氧化能力遠(yuǎn)優(yōu)于BHT。

圖2 a DPPH反應(yīng)體系中千金子提取物變化曲線;b DPPH反應(yīng)體系中BHT的標(biāo)準(zhǔn)曲線;c ABTS反應(yīng)體系中千金子提取物;d BHT抗氧化性比較

2.4 β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)

如圖3所示，無(wú)論加入千金子乙醇提取物，還是BHT，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液吸光度逐漸減小，直至消失。2.0mg/mL的千金子乙醇提取物和BHT的抗氧化活性分別為5.15%和12.22%，這說(shuō)明千金子乙醇提取物的抗氧化活性要弱于BHT。結(jié)合清除自由基試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明千金子乙醇提取物中具有抗氧化活性的組分多為水溶性化合物[21]。

3 結(jié)論

本文對(duì)千金子乙醇提取物采用UPLC-TOF-MS，共鑒定包括4個(gè)黃酮類(lèi)化合物（青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荊子黃酮）和2個(gè)香豆素類(lèi)化合物（瑞香素和雙七葉內(nèi)酯）在內(nèi)的17個(gè)化合物?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，千金子乙醇提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率優(yōu)于BHT，對(duì)β-胡蘿卜素的漂白能力次于BHT。這與千金子中含有較多水溶性的黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)化合物直接相關(guān)。UPLC-TOF-MS鑒定結(jié)果也驗(yàn)證了該結(jié)論的可靠性。本研究可為千金子中天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]劉玉婷，楊洋，弓佩含，等.千金子化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（13）：220-225.

[2]焦威，魯璐，鄧美彩，等.千金子化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2010，41（2）：181-187.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4]董偉.大戟科千金子化學(xué)成分的研究[D].昆明：云南民族大學(xué)，2017.

[5]楊君，盧禁，王書(shū)云，等.千金子中非萜類(lèi)化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，33（3）：194-197.

[6]王正平，高燕，趙渤年.千金子的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2014，16（1）：58-61.

[7]楊珊珊.千金子中抗腫瘤成分的分離及藥理學(xué)研究[D].天津：天津大學(xué)，2016.

[8]景引.氧自由基損傷與皮膚美容及其預(yù)防措施[J].中國(guó)醫(yī)療美容，2017，7（1）：63-65.

[9]常艷芬.基于代謝組學(xué)的黃芩抗衰老作用評(píng)價(jià)及機(jī)制研究[D].太原：山西大學(xué)，2016.

[10]溫晉芳，姜在民，苑文柯，等.唐棣果黃酮類(lèi)化合物的提取及抗氧化性研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，32（2）：218-224.

[11]史資，陳新，劉梁.DPPH法測(cè)定茄葉斑鳩菊不同極性部位的抗氧化活性[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38（9）：19-21.

[12]周瑋婧，李書(shū)藝，王文娟.蓮藕節(jié)中多酚提取物體外抗氧化活性研究[J].食品科技，2016，31（12）：158-162.

[13]李培源，盧汝梅，蘇煒，等.ABTS法測(cè)定福州薯蕷的抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（12）：3173-3175.

[14]陳小強(qiáng)，劉帥，于雯，等.黃檗果實(shí)精油的化學(xué)成分、抗氧化及細(xì)胞毒活性[J].精細(xì)化工，2016，33（2）：147-151.

[15]詹濟(jì)華，孟英才，譚洋，等.鐵莧菜乙醇提取物抗流感活性及其機(jī)理的初步研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2016（11）：1706-1711.

[16]Larrauri JA.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，1998，46（7）：2694-2697.

[17]Tovar-Barrios G，Ramírez ALS，Valle-Molinares RH，et al.Antioxidant activity of poriferansfrom the colombian caribbean rocky coast by DPPH and ABTS method Type[J].Pharmacologyonline，2016，1（1）：64-71.

[18]沈旭丹，吳月德，龐鳳，等.幾種植物提取物的抗氧化活性比較[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，15（1）：34-39.

[19]封家福，趙琦，衛(wèi)秀敏，等.千金子中6，7-二羥基香豆素的分離鑒定及抗氧化活性研究[J].糧油食品科技，2015，23（3）：32-35.

[20]張娜，陳文娟，柳青青，等.香豆素類(lèi)化合物清除自由基及抗腫瘤活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（1）：1-5.

[21]曹艷紅.三種新疆地產(chǎn)商品化精油的GC-MS成分分析及抗氧化活性研究[D].烏魯木齊：新疆大學(xué)，2014.