張輝, 張賡

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院感染科(天津 301800)

臨床上將乙型肝炎(乙肝)病毒檢測為陽性，且病程超過6個月或雖然發(fā)病日期不明確而臨床上有慢性肝炎表現(xiàn)的患者稱為慢性乙肝，主要由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，在我國屬于乙類傳染病，主要通過母嬰、血液制品、皮膚黏膜和性接觸傳播。不同宿主、環(huán)境因素均可導(dǎo)致乙肝病毒感染患者出現(xiàn)不同的結(jié)局和臨床類型，如不能及時控制，則會發(fā)展為慢性乙肝，在全球范圍內(nèi)均較常見[1-3]，尤其是我國。長期的慢性乙肝可逐漸發(fā)展至肝硬化，甚至肝癌[4-6]。免疫機(jī)制在乙肝病毒感染患者病程遷延中發(fā)揮了重要作用，既往研究主要集中在Th1/Th2免疫平衡上，但逐漸有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分免疫現(xiàn)象不能使用Th1/Th2免疫平衡解釋，所以越來越多的學(xué)者開始重視Th17/Treg免疫平衡，研究顯示Th17/Treg在慢性乙肝患者中存在平衡失調(diào)，與慢性乙肝患者病情相關(guān)[7-9]。但Th17/Treg與慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量的相關(guān)性尚不清楚，為此我們設(shè)計了本研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年11月至2018年11月，前瞻性收集我院收治的慢性乙肝患者100例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性乙肝；(2)在我院接受診治，可以獲得檢測標(biāo)本；(3)年齡18～65歲；(4)同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型肝炎；(2)肝癌或肝臟其他重大病變；(3)其他類型感染；(4)惡性腫瘤；(6)心腦肺功能不全；(6)腎功能不全；(7)潰瘍性結(jié)腸炎等免疫系統(tǒng)疾病；(8)不能配合完成本研究。研究期間根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入慢性乙肝患者100例作為觀察組，同期收集100例至我院健康體檢的成人作為對照組；收集100例至我院診治的乙肝病毒攜帶者(乙肝表面抗原陽性，但未發(fā)病，無慢性肝炎癥狀)作為攜帶組；攜帶組和對照組均無上述相關(guān)疾病。3組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較

表1 3組一般資料比較

項目例數(shù)年齡(歲)男性[(例)%]體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)觀察組10046.01±10.1865(65.00)25.00±2.74攜帶組10046.65±9.9260(60.00)25.43±3.02對照組10047.45±9.8562(62.00)25.33±2.53F/2值0.8730.1941.016P值0.3840.6590.311

1.2 觀察指標(biāo) (1)外周血中Th17、Treg細(xì)胞；(2)外周血中白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-10；(3)乙肝病毒DNA載量；(4)肝臟病變纖維化程度。

1.3 檢測方法 (1)入院后完善健康知識宣教和知情同意書簽署，于24 h內(nèi)，取患者空腹血5 mL，利用美國Baekman公司提供的流式細(xì)胞儀測定樣本中Th17、Treg表達(dá)水平，淋巴細(xì)胞亞群熒光直標(biāo)單顆?？贵w試劑購自美國Backman公司，該項目檢測由上海裕隆醫(yī)學(xué)檢驗所股份有限公司完成。(2)外周血中IL-17、IL-10：于入院24 h內(nèi)，取患者空腹血5 mL，使用離心機(jī)(3 000 r/min)離心10 min后，取上層血清，使用ELISA法檢測血清中IL-17、IL-10表達(dá)水平，相關(guān)試劑盒由上海裕隆醫(yī)學(xué)檢驗所股份有限公司提供。(3)乙肝病毒DNA載量：使用熒光定量PCR法檢測慢性乙肝患者血清中(血清獲取方式同上)乙肝病毒DNA載量。(4)肝臟病變纖維化程度：行肝活組織檢查，對樣本進(jìn)行HE染色、Masson染色，評估慢性乙肝患者肝臟纖維化程度分級(S分級，S0～S1為輕度纖維化，S2～S4為重度纖維化)。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血中Th17、Treg細(xì)胞水平比較 與對照組或攜帶組比較，觀察組患者Th17、Treg細(xì)胞水平增高。見表2。

表2 3組外周血中Th17、Treg細(xì)胞水平比較

表2 3組外周血中Th17、Treg細(xì)胞水平比較

項目例數(shù)Th17Treg觀察組1003.07±1.319.80±2.58攜帶組1002.65±1.33?8.12±2.12?對照組1001.95±0.85?△7.70±2.75?△F值7.1965.577P值0.0000.000

*與觀察組比較P<0.05；△與攜帶組比較P<0.05

2.2 3組外周血IL-17、IL-10水平比較 與對照組或攜帶組比較，觀察組患者IL-17、IL-10水平增高。見表3。

2.3 慢性乙肝患者病毒學(xué)參數(shù) 100例慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量為(6.42±1.76)×104IU/mL。乙肝表面抗原陽性者100例，乙肝e抗原陽性者62例，乙肝表面抗體陽性71例，e抗體陽性者58例，核心抗體陽性者100例。慢性乙肝患者肝臟為輕度纖維化的56例，重度纖維化的44例。

表3 3組外周血IL-17、IL-10水平比較

表3 3組外周血IL-17、IL-10水平比較

項目例數(shù)IL-17IL-10觀察組10034.17±8.9229.76±7.05攜帶組10028.78±7.76?26.38±6.12?對照組10023.30±8.19?△23.65±5.48?△F值8.9716.845P值0.0000.000

*與觀察組比較P<0.05；△與攜帶組比較P<0.05

2.4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關(guān)性 與肝臟輕度纖維化的患者相比，重度纖維化患者Th17、Treg、IL-17、IL-10均顯著升高(P<0.05)。見表4。

2.5 慢性乙肝患者Th17/Treg與乙肝病毒DNA載量的相關(guān)性 慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量與Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。見表5和圖1。

表4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關(guān)性

表4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關(guān)性

項目例數(shù)Th17(%)Treg(%)IL-17(pg/mL)IL-10(pg/mL)輕度纖維化562.12±0.547.56±1.2526.25±2.0924.07±2.32重度纖維化443.32±0.588.83±1.1832.00±1.9229.32±2.71t值10.6775.16814.15010.430P值0.0000.0000.0000.000

3 討論

慢性乙肝如果不能得到及時控制，可逐漸發(fā)展至肝硬化和肝癌，是我國肝癌最主要的誘發(fā)因素。免疫功能在慢性乙肝患者中的作用逐漸被重視，本研究探討了Th17/Treg與慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量的相關(guān)性，結(jié)果顯示Th17/Treg及其細(xì)胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且與患者乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關(guān)，可能參與了肝臟纖維化的發(fā)展過程。

表5 慢性乙肝患者Th17/Treg與乙肝病毒DNA載量的相關(guān)性

A:Th17;B:Treg;C:IL-17;D:IL-10

乙型病毒性肝炎是由于感染乙肝病毒引起，是一種雙鏈、環(huán)形、不完全閉合的DNA病毒，核蛋白(HBcAg)是其核心部分，外層則是病毒的外膜，因此乙型病毒性肝炎抵抗力較強(qiáng)，在外界可以存活，甚至可以耐受一般濃度的消毒劑，即使在60℃高溫中還可以耐受4 h，煮沸10 min、高壓蒸汽消毒2 min方可滅活，因此具有較強(qiáng)的傳染性，福建省的一項流行病學(xué)調(diào)查顯示乙肝病毒的發(fā)病率高達(dá)172.94/10萬[10]。乙肝病毒DNA載量是判斷乙肝病毒有無復(fù)制的“金指標(biāo)”，可以用來評估人體內(nèi)存在乙肝病毒的多少和活躍性，乙肝病毒DNA載量越高，說明傳染性越強(qiáng)，如果乙肝病毒DNA載量大于1 000或者1.0e+ 003拷貝/mL，說明乙肝病毒DNA呈陽性，提示HBV復(fù)制和有傳染性，是乙肝治療過程中監(jiān)測療效的重要手段[11-14]。本研究顯示Th17/Treg及其細(xì)胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且與患者乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關(guān)，提示慢性乙肝患者病毒活躍性越強(qiáng)，Th17/Treg及其細(xì)胞因子(IL-17和IL-10)越高，最終導(dǎo)致肝臟纖維化。Th17是一種促炎細(xì)胞，主要通過產(chǎn)生IL-17發(fā)揮其生理作用，是抗感染免疫中的效應(yīng)性T細(xì)胞，當(dāng)乙肝病毒活躍時，機(jī)體代償性地提高Th17、IL-17，以殺滅乙肝病毒[15-17]。Th17、IL-17增高，可以促進(jìn)血管源性細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤微血管生成，促進(jìn)腫瘤生成、轉(zhuǎn)移和浸潤。但是慢性乙肝患者病毒活躍時，肝細(xì)胞炎性反應(yīng)加重，導(dǎo)致肝功能損傷，為調(diào)控免疫應(yīng)答對肝細(xì)胞的損傷，機(jī)體會代償性地增加免疫調(diào)控作用。IL-17的增加，還可以誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，激活STST3信號通路，促進(jìn)肝臟纖維化的發(fā)展過程。Treg和IL-10是一種免疫抑制細(xì)胞和因子，其水平升高是慢性乙肝患者的一種自我保護(hù)作用，抑制肝組織中炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到減輕肝細(xì)胞損傷的作用[17-21]。Treg由Sakaguchi于1995年報道，目前已經(jīng)成為腫瘤治療的重要靶點，在腫瘤患者中，具有免疫抑制和免疫無功能作用，可以幫助肝癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃脫，加速肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[22-24]。異常增高的Treg細(xì)胞，還可以破壞CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，破壞其他免疫殺傷機(jī)制，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的快速生長和轉(zhuǎn)移。目前已有研究證實了Th17/Treg平衡失調(diào)與慢性乙肝患者肝功能損傷、肝纖維化有關(guān)[25-26]。支持本研究，本研究顯示與肝臟輕度纖維化的患者相比，重度纖維化的患者Th17/Treg平衡失調(diào)更嚴(yán)重，但本研究進(jìn)一步探討了Th17/Treg平衡失調(diào)與乙肝病毒DNA載量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量與Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。說明Th17/Treg平衡失調(diào)可能可以促進(jìn)乙肝病毒在體內(nèi)的復(fù)制，進(jìn)而加重肝功能損傷。調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡功能，可能有利于減輕慢性乙肝患者肝纖維化發(fā)展進(jìn)程，但目前相關(guān)研究尚缺乏，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究的主要不足為未能對乙肝病毒在體內(nèi)的復(fù)制與Th17/Treg平衡功能的相關(guān)性進(jìn)行更深入的探討，且病例數(shù)僅為100例，相對不足。

綜上所述，外周血中Th17、Treg、IL-17和IL-10在慢性乙肝患者中均升高，與乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關(guān)，可能參與了肝臟纖維化的發(fā)展過程。