薄其付，李勝男，李桂慶，劉玉璽，劉峰*

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)系，山東濰坊 261053；*通訊作者 劉峰 liufengwfmc@163.com

前列腺癌是歐美男性第二大致死性癌癥[1]。隨著我國人口老齡化的加劇，老年男性的比例不斷增加，前列腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[2]。目前國內(nèi)的前列腺癌病例構(gòu)成以晚期為主[3]。因此，建立前列腺癌動物模型對新型抗癌藥物的研究有重大意義。常見的前列腺癌動物模型包括種植型和外科原位移植型。種植性前列腺癌動物模型按部位分為皮下種植、腹腔內(nèi)種植、腎包膜下種植以及骨骼種植等[4]；外科原位移植型包括原位瘤細(xì)胞注射法和瘤組織塊移植法[5]。盡管通過細(xì)胞懸液法建立的前列腺癌原位移植瘤模型較為成功，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，但由于小鼠前列腺解剖結(jié)構(gòu)較小，操作空間有限，細(xì)胞懸液注射時容易溢出靶器官或誤注入血管而造成人為轉(zhuǎn)移；另外，即使未將細(xì)胞懸液直接注入血管，在注射細(xì)胞懸液后的10～180 min內(nèi)，細(xì)胞懸液也會自發(fā)進(jìn)入淋巴管或血管，從而造成人為的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。本研究參考文獻(xiàn)[7]采用的組織塊原位種植法，利用C57BL6小鼠建立前列腺原位腫瘤模型，觀察其影像學(xué)特點，為探索前列腺癌的生長轉(zhuǎn)移機(jī)制及其藥物實驗提供適宜的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 C57BL6雄性近交系小鼠35只（濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：Scxk魯20140007），鼠齡6～8周，體重18～23 g；恒溫（20～26℃）、恒濕（40%～70%）、無菌隔離飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)；自由進(jìn)食清潔水及高壓滅菌小鼠料（購自北京市實驗動物中心）。

小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所）；胎牛血清（購自杭州四季青胎牛血清公司）；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（無硝酸鈣，含2.05 ml谷氨酰胺，購自美國HyClone公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（購自北京Solarbio公司）。

1.2 儀器 MR（3.0T，GE）；雙目連續(xù)變倍體視顯微鏡（上海精密，XTL2300）；游標(biāo)卡尺；電子天平（MP21001，上海恒平）；生物組織包埋機(jī)（KD-BM，瑞士Leica）；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2235，瑞士Leica）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 d換1次培養(yǎng)液，瘤細(xì)胞貼壁并生長至>70%，用胰蛋白酶消化并吹散，制成單細(xì)胞懸液。

1.3.2 C57BL6小鼠前列腺癌模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇6～8周齡C57BL6雄鼠4只，用乙醚法麻醉，將RM-1前列腺癌腫瘤細(xì)胞株傳代3次后注射（細(xì)胞濃度為2×106個/ml）到小鼠背部皮下，每只注射0.1 ml，次日起觀察腫瘤生長情況。

在上述小鼠皮下腫瘤模型直徑長至1 cm時，采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇2只小鼠作為小鼠原位腫瘤移植模型材料給予4%水合氯醛0.1 ml/10g。剝離腫瘤組織后，將取出的瘤組織塊浸泡在0.9%氯化鈉溶液中剪成約1 ml注射器針頭大小（用1 ml注射器針頭將其吸住且不至于輕易漏掉為準(zhǔn)）備用。組織塊浸泡時間不超過30 min。小鼠用上述麻醉方法麻醉，仰臥于硬紙板上并固定，常規(guī)備皮消毒，沿小鼠下腹部腹白線作長1.0～1.5 cm切口，顯露腹腔。在10倍物鏡下尋找膀胱將其向頭端翻轉(zhuǎn)，并向兩側(cè)推開脂肪組織，顯露前列腺，鏡下呈粉紅色島狀結(jié)構(gòu)，有明顯的腺體組織特征。由一人在顯微鏡下主導(dǎo)找到前列腺的準(zhǔn)確位置，另一操作者在主導(dǎo)人的引導(dǎo)下將提前準(zhǔn)備好的瘤組織塊用1 ml注射器注射到前列腺組織包膜下，然后將器官歸位，用6-0可吸收腸線直接關(guān)腹，待小鼠蘇醒后回籠。術(shù)中操作要求輕柔、準(zhǔn)確，避免損傷正常組織。按上述步驟共制作前列腺癌原位移植瘤模型鼠30只。

1.4 動物模型結(jié)果的評價

1.4.1 大體觀察 自腫瘤種植完成起每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等一般生命體征；小鼠每隔3 d稱重1次。

1.4.2 影像學(xué)觀察 腫瘤種植完成后第8天采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇6只模型鼠行MRI掃描，觀察腫瘤大小、侵犯部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。MRI掃描方法：掃描序列軸位T2WI壓脂序列（TR 2100 ms，TE 90 ms），冠狀位T2WI壓脂（TR 3000 ms，TE 90 ms），軸位擴(kuò)散加權(quán)成像（TR 3950 ms，TE 77 ms），b值為600 s/mm2，矩陣128×96，視野90 mm×120 mm，掃描層厚3 mm，間隔0.3 mm，激勵次數(shù)4。

1.4.3 病理學(xué)觀察 待小鼠前列腺原位種植腫瘤形成后，用頸椎脫臼法處死小鼠后取其腫瘤組織，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和短徑，并參考文獻(xiàn)[6]計算腫瘤體積。將腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，包埋。自固定液中取出標(biāo)本，流水沖洗過夜。參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行梯度乙醇脫水各15 min；二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ各20 min；浸蠟2 h（石蠟溫度60℃），包埋。完成制片后在顯微鏡下觀察。

1.4.4 主要觀察指標(biāo) 主要觀察腫瘤成瘤效果以及該模型的肝臟、肺、脾臟、腎臟、腎上腺、椎體及淋 巴結(jié)等轉(zhuǎn)移情況。比較該腫瘤模型的形態(tài)學(xué)特點與影像學(xué)表現(xiàn)的符合程度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件，計量資料以x±s表示，計算模型鼠腫瘤體積，總體呈正態(tài)分布。采用配對樣本t檢驗對MRI測量結(jié)果與游標(biāo)卡尺測量結(jié)果進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物大體觀察結(jié)果 模型鼠在瘤體植入后第1周狀況均良好，精神正常，皮毛光滑，進(jìn)食正常，體重?zé)o減輕，活動度正常。7 d左右腹部可觸及直徑約1 cm腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬。8～15 d一般狀況呈進(jìn)行性衰竭表現(xiàn)，鼠毛失去光澤，進(jìn)食減少，體重減輕，活動下降；且上述癥狀隨著時間延長而進(jìn)行性加重，直至呼吸淺快不能進(jìn)食。

2.2 建模及影像學(xué)結(jié)果 模型鼠解剖后可見較大的前列腺癌病灶，腫瘤向前膨出，將包膜擠出一定角度和高度提示包膜受累；肝臟、腎臟表面可見單個或多個轉(zhuǎn)移瘤組織，邊界清、體積小。此種方法成瘤率為96.7%（29/30），周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為96.7%（29/30），腹水形成率為96.7%（29/30），肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為93.3%（28/30），腎轉(zhuǎn)移發(fā)生率為0.33%（1/30），肉眼未見明顯肺部轉(zhuǎn)移，小鼠平均生存時間（12.7±1.8）d。MRI結(jié)果見圖1。

圖1 模型鼠腫瘤MRI圖像。冠狀位T2WI可見腫瘤（箭）位于下腹部，形態(tài)規(guī)則，與周圍組織分界清楚，呈等信號，信號均勻（A）；軸位T2WI（箭）位于下腹部，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，信號尚均勻（B）

2.3 病理學(xué)結(jié)果 瘤組織呈不規(guī)則的近橢圓形，包膜不完整，質(zhì)中，呈灰白、灰黃結(jié)節(jié)樣，切面灰白，部分切面有出血壞死，瘤組織與殘存前列腺組織界限不清；光鏡下可見大量腫瘤細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)濃染，呈多形性，核質(zhì)比增大，可見異常病理性核分 裂象；大部分腺體被腫瘤細(xì)胞破壞，腫瘤組織呈條索 狀或散在成團(tuán)雜亂分布于前列腺體間質(zhì)中（圖2）。

圖2 小鼠前列腺癌組織。箭示前列腺正常腺體區(qū)域，箭頭示腫瘤區(qū)域（HE，×10）

2.4 MRI與游標(biāo)卡尺測量結(jié)果比較 MRI與游標(biāo)卡尺對小鼠模型腫瘤體積的測量結(jié)果分別為（505.17±196.24）mm3、（460.33±185.59）mm3，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.374，P=0.064）。

3 討論

與西方國家相比，我國前列腺癌發(fā)病率尚處于低水平。隨著我國醫(yī)療水平的改善、國民生活水平的提高和飲食習(xí)慣的西方化，前列腺癌的發(fā)病率也呈不斷增高趨勢[9]。由于前列腺癌發(fā)病早期癥狀較輕，容易被忽視，確診時疾病大多已經(jīng)進(jìn)行到晚期或轉(zhuǎn)移的可能性較大[3]。前列腺癌在人類體內(nèi)的發(fā)展是一個多步驟的過程，通過多個階段最終轉(zhuǎn)移到骨、肺、肝等處，因此建立一種合適的動物模型并闡明其機(jī)制，進(jìn)而尋找不同的治療方法以控制腫瘤的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有重要意義[10]。既往研究對前列腺癌動物模型建立的不同方法進(jìn)行了嘗試與探討。Bobek等[7]進(jìn)行反復(fù)試驗后對原位種植技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，通過前列腺癌細(xì)胞先嘗試接種至裸鼠皮下形成腫瘤后，再將瘤組織取出，分切成1 mm3等體積瘤組織塊，然后將其種植到小鼠背側(cè)葉，劃開前列腺包膜，放入事先制備的瘤組織塊，用8-0可吸收線縫合包膜，再用6-0可吸收線關(guān)腹。但這種方法對操作者的個人技術(shù)、實驗室設(shè)備要求較高，且操作者需進(jìn)行專門的訓(xùn)練和多次練習(xí)達(dá)到熟練的程度后方可實行。在汲取前人研究成果的基礎(chǔ)上，本研究對小鼠前列腺癌原位移植模型的建立進(jìn)行了積極探索與創(chuàng)新，采用價格相對低廉、飼養(yǎng)環(huán)境要求不高的C57BL6小鼠作為實驗小鼠，實驗過程中在體視顯微鏡下，用注射器注射法將瘤組織塊注射到前列腺組織包膜下，然后將器官歸位，用6-0可吸收腸線直接關(guān)腹，從而降低了實驗的難度，縮短了實驗操作的進(jìn)程。

本研究建立了C57BL6小鼠前列腺癌原位移植瘤模型，并運(yùn)用MRI觀察其腫瘤生長和轉(zhuǎn)移特點。實驗結(jié)果表明，此法建立的原位組織塊種植模型成瘤率為96.7%，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為100%；肝轉(zhuǎn)移發(fā)生 率為90%；腎轉(zhuǎn)移率為0.33%，均與既往研究結(jié)果相近[11-12]。實驗過程中肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)有明確的肺部轉(zhuǎn)移灶，可能與荷瘤小鼠生存期短、過早發(fā)生肝衰竭死亡有關(guān)。同時，該實驗中還觀察到模型鼠腹水形成率極高，近乎達(dá)100%，提示瘤組織可能侵犯腹膜進(jìn)而損傷腹膜毛細(xì)血管，使血管通透性增加，導(dǎo)致大量液體與蛋白質(zhì)滲入腹腔。然而，此項觀察結(jié)果鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報道，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究驗證。該實驗中瘤組織的T2WI表現(xiàn)與人類相似，呈中等信號，采用MRI對腫瘤體積的測量結(jié)果與模型鼠解剖后用游標(biāo)卡尺的測量結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與國外相關(guān)文獻(xiàn)報道相符[13]。

隨著動物模型技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，近年來源于患者原代腫瘤組織的腫瘤移植模型（patient-derived xenograft，PDX）受到關(guān)注。但PDX模型操作技術(shù)要求高，標(biāo)本從手術(shù)室獲得后需要外科醫(yī)師、組織學(xué)家和研究者密切配合。同時，由于患者來源的腫瘤組織數(shù)量有限，會受到醫(yī)學(xué)倫理道德的限制，造成已有的原代模型數(shù)量少，而傳代的樣本需進(jìn)行組織病理學(xué)檢測，確定與原始樣本的一致性，最終在經(jīng)歷了這一系列精確復(fù)雜的操作后，PDX模型的移植成瘤率平均僅為25%左右[14-15]。本實驗建立的C57BL6小鼠前列腺癌原位移植模型較PDX模型具有建模周期短、移植瘤成功率高、操作簡單等特點，且其影像學(xué)和病理學(xué)表現(xiàn)與人類前列腺癌相似，可以作為觀察人類前列腺癌的動物模型。

本研究的局限性為：人類前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，但本模型并未觀察到有相關(guān)骨轉(zhuǎn)移跡象，其原因可能與生存期短、小鼠較早出現(xiàn)肝衰竭而影響腫瘤進(jìn)一步發(fā)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)。