楊平　黃靜敏　陳晶　劉小青　蘭全學(xué)

摘要 分別采用國家標(biāo)準(zhǔn)MPN法、紙片法改良MPN法（R-MPN）和疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF）對50個海水及牡蠣樣品進行檢測。結(jié)果表明，R-MPN法和HGMF法的檢出量比另外2種方法高，差異顯著（P<0.05）。紙片法的特異性最高，其次是HGMF法，R-MPN法和MPN法的特異性相對較低：本文通過比較4種副溶血性弧菌檢驗方法的檢出量和特異性，以期為今后的檢測方法改進提供參考。

關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌;MPN法;紙片法;改良MPN法;疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF）

中圖分類號 TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0238-02

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見的食源性致病菌"。尤其在沿海地區(qū)，自1998年來副溶血性弧菌引起細(xì)菌性食物中毒危害已取代沙門氏菌12。由于副溶血性弧菌廣泛存在于海水以及魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品中，近年來隨著保鮮和物流業(yè)的迅速發(fā)展，海產(chǎn)品得以運輸?shù)絻?nèi)陸銷售，而副溶血性弧菌污染地區(qū)范圍正隨著海產(chǎn)品消費范圍的擴大而擴大B。副溶血性弧菌對環(huán)境條件很敏感，海產(chǎn)品從沿海運輸?shù)絻?nèi)陸一般都是采取冷凍保鮮等方式，在此過程中副溶血性弧菌易發(fā)生亞致死損傷4。但只要環(huán)境適宜，損傷的副溶血性弧菌會發(fā)生復(fù)蘇，這對水產(chǎn)品的食品安全造成了潛在的危害。人們在食用被副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品后，極易引起急性腸胃炎。少數(shù)嚴(yán)重病人會產(chǎn)生休克、昏迷而死亡。污染范圍及保藏運輸條件等變化無疑對海產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)控形成新的挑戰(zhàn)。檢測手段也應(yīng)對新變化做出適當(dāng)調(diào)整，結(jié)合檢驗方法的特點綜合運用。

目前，我國建立的副溶血性弧菌國家標(biāo)準(zhǔn)定量檢測方法為GB4789.7-2013。MPN法是最常用的細(xì)菌定量檢測方法，但其得出的結(jié)果是樣本中活菌數(shù)量的最大或然數(shù)，屬于間接的半定量分析方法，而且操作過程繁瑣。美國FDA采用的是HGMF法，通過疏水網(wǎng)格濾膜過濾截留樣品中的細(xì)菌，再進行選擇性培養(yǎng)，得到的結(jié)果以CFU/g（mL）為單位，是一種直接定量法。自20世紀(jì)70年代發(fā)展至今，HGMF已成功應(yīng)用于各種食源性致病菌的檢測中15-7。此外，本實驗室已建立了疏水濾膜快速定量方法8以及Ray等建立的改進MPN法（R-MPN），但不同檢測方法利用菌的某個特性對細(xì)菌進行檢測，都有其優(yōu)缺點，沒有一種方法能確保100%準(zhǔn)確，只能綜合考慮樣品性質(zhì)等情況，選擇某種方法或聯(lián)合使用。因此，本文通過對4種副溶血性弧菌定量方法進行探討研究，綜合考慮方法的優(yōu)缺點，以期為更好地控制副溶血性弧菌引發(fā)的食源性疾病提供參考依據(jù)。

1試驗材料

1.1樣品采集

50個海水以及新鮮或冰凍的牡蠣采集于深圳市的海鮮市場、農(nóng)批市場、超市等。采集300mL海水樣品置于500mL無菌廣口瓶中，牡蠣樣品采集后立即置于4C冰箱保存，24～48h內(nèi)完成測試（通常24h內(nèi)）;冷凍樣品置于-18C冰箱保存。

1.2培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基和試劑包括蛋白胨/吐溫80（PT）、蛋白胨/吐溫80/3%NaCl（PTS）、副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基（VPCM，法國科瑪嘉）、大豆酪蛋白瓊脂（TSA）、3%NaCl大豆酪蛋白瓊脂、胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAM）、3%NaCl胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAMS）、ISO-GRID疏水網(wǎng)格濾膜（NEOGEN）、副溶血性弧菌鑒定紙片。

2試驗方法

2.14種檢驗方法

2.1.1國家標(biāo)準(zhǔn)MPN法。根據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7-2013）要求進行。

2.1.2改良MPN法（R-MPN法）。R-MPN法是Ray等在原有MPN法的基礎(chǔ)上增加一步預(yù)富集過程，即先經(jīng)過胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）預(yù)富集2h后，接著在3%NaClTSB培養(yǎng)過夜，有利于副容血性弧菌受損細(xì)胞的修復(fù)，再通過陰離子葡萄糖鹽肉湯（GST）36C培養(yǎng)過夜，鑒定。

2.1.3紙片法。把樣品稀釋液接種副溶血性弧菌鑒定紙片，于42C條件下培養(yǎng)24h，按照產(chǎn)品說明書計算陽性菌落數(shù)。

2.1.4疏水網(wǎng)格濾膜法（HGMF法）。通過疏水網(wǎng)格濾膜過濾截留樣品中的細(xì)菌，然后把濾膜放置在TSAMS培養(yǎng)基上36C修復(fù)4～5h后，轉(zhuǎn)到副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基上36C選擇性培養(yǎng)過夜，計數(shù)。

2.2副溶血性弧菌檢測

海水樣品：海水樣品采用上述4種方法來進行檢測，MPN法和R-MPN法選擇10.0、1.00.1mL3個稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品;HGMF法選擇100.0、10.0、1.0mL3個稀釋度。

牡蠣樣品：稱取25g樣品加入225mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水內(nèi)，均質(zhì)器拍打混勻制成1：10均質(zhì)液，采取，上述4種方法對均質(zhì)液進行定量檢測。MPN法R-MPN法選擇10.0、1.0、0.1mL3個稀釋度;HGMF法選擇1.000.10、0.01mL3個稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品。

所有試驗樣品均做3個平行，檢測結(jié)果以幾何平均值表示。

2.3菌株鑒定

分別從4種方法的培養(yǎng)物中根據(jù)菌落形態(tài)挑取50個可疑菌落劃線純化，純培養(yǎng)的單菌落進行氧化酶試驗、3%NaCl三糖鐵瓊脂試驗和嗜鹽性試驗。采用VITEK2Compact全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株進行確證鑒定。

2.4統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

3結(jié)果與分析

海水樣品和牡蠣樣品中副溶血性弧菌的定量檢測情況如表1所示。通過對比4種檢驗方法，可以看出，4種檢驗方法中，R-MPN法和HGMF法對于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量較高，而且2種方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。HGMF法對于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量最高，其次是R-MPN法，MPN法和紙片法檢測量相對較低。從海水樣品的檢測結(jié)果來看，4種檢測方法的檢出量之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。而對于牡蠣樣品，R-MPN法和HGMF法的檢出量之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但這2種方法的檢出量都明顯高于紙片法和MPN法（P<0.05）。牡蠣樣品中副溶血性弧菌的檢出量基本比海水樣品的數(shù)量高出2個數(shù)量級。

分別從4種方法中隨機挑取50個副溶血性弧菌可疑菌落，采用VITEK2Compact全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株進行鑒定來檢驗這幾種方法的特異性。可疑菌落的挑取主要根據(jù)菌落的形態(tài)特征，沒有采用其他生化手段作為輔助。紙片法的陽性率為98%，HGMF法的陽性率為85%，而采用R-MPN法和MPN法的陽性率分別為60%和66%，采用紙片法和HGMF法的特異性明顯高于R-MPN法和MPN法（P<0.05）。

4結(jié)論與討論

比較4種副溶血性弧菌檢驗方法的檢出量，R-MPN法和HGMF法中副溶血性弧菌的檢出量較另外2種方法高，可能因為這2種方法都對副溶血性弧菌受損細(xì)胞有一個修復(fù)的步驟，R-MPN法和HGMF法首先通過在沒有選擇性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間再進行選擇性培養(yǎng)，能有效修復(fù)冷藏或冷凍過程中被損傷的副溶血性弧菌細(xì)胞。Ray等研究經(jīng)過冷藏或冷凍處理的副溶血性弧菌受損細(xì)胞的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)在TSB培養(yǎng)2h后，接著在3%NaClTSB培養(yǎng)過夜，是一個非常有效的MPN計數(shù)法前修復(fù)處理方法。通過前期試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在TSAMS上培養(yǎng)4～5h后，能有效修復(fù)副溶血性弧菌受損細(xì)胞。此外，不同取樣量也會影響結(jié)果的檢測量。如海水樣品，HGMF法1次共檢測11.0mL樣品，而MPN法1次只檢測33.33mL樣品量。對于牡蠣樣品，因為1：10均質(zhì)液容易堵塞濾膜，所以HGMF法的樣品總分析量降為0.11g。此外，復(fù)雜的數(shù)學(xué)換算也會對檢出量有一定影響。R-MPN法和MPN法得出的結(jié)果是活菌數(shù)量，得到的值單位為MPN/g（mL），可通過公式換算成CFU/g，但跟實際菌含量有一定差別。

從4種副溶血性弧菌檢驗方法的特異性結(jié)果來看，紙片法和HGMF法檢測副溶血性弧菌的特異性比MPN法及R-MPN法好。紙片法是在42C條件下培養(yǎng)的，研究表明，提高檢測溫度能有效抑制其他微生物的生長。然而，紙片法的特異性雖然高，但是該方法的檢出量卻很低，容易出現(xiàn)漏檢的情況，尤其對于在運輸?shù)冗^程中產(chǎn)生損傷或致死的細(xì)胞。HGMF法的特異性比紙片法稍低，但檢出量高，對損傷細(xì)胞也有很好的修復(fù)步驟，不容易出現(xiàn)漏檢的情況。R-MPN法和MPN法的方法特異性相當(dāng)。

除了考慮方法的檢出量和特異性外，方法的效率性也非常重要。紙片法無需配制培養(yǎng)基，而且操作簡單，可減少生化鑒定步驟，快速簡便。HGMF法可以同時過濾多個樣品，同時可以縮短富集培養(yǎng)的時間。R-MPN法和MPN法用于微生物計數(shù)時包括富集、分離和鑒定等所有步驟，不論是用3管6管還是9管MPN法，每個稀釋管都要經(jīng)過以上各個步驟，需要大量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)步驟，操作過程略為繁瑣，其得出的試驗結(jié)果是樣本中目的菌活菌數(shù)量的統(tǒng)計學(xué)估計值。

綜合考慮4種方法的優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)樣品和檢測要求等，結(jié)合方法的特點綜合運用。如在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，紙片法快速簡便，更具優(yōu)勢。MPN法雖然繁瑣，但該方法是目前國家標(biāo)準(zhǔn)檢定副溶血性弧菌的定量方法，檢測結(jié)果得到國家檢定結(jié)構(gòu)和企業(yè)等的認(rèn)可。相比于MPN法，HGMF法處理大量樣品，使受損細(xì)胞得以生長并被檢出，檢出量高，特異性好，可為今后改進國家標(biāo)準(zhǔn)法提高檢驗效率提供一定參考。

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