董莉 申強 郭淼 李勐 張兆琪 陳慧軍

動脈粥樣硬化性疾病是威脅人類生命健康的“頭號殺手”。研究表明，炎癥在整個動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和最終到破裂導致心腦血管事件的過程中起著重要作用[1-5]。近期研究顯示，利用動態(tài)增強核磁共振(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)可以對在活體動脈硬化炎性反應進行成像和定量分析，但僅限于對中重度動脈粥樣化斑塊的檢測，對早期動脈硬化炎性反應的檢測和定量分析方法仍需進一步研究。本研究基于DCE-MRI 原理，探索一種新的黑血動態(tài)增強核磁共振成像技術在定量測量早期動脈粥樣硬化炎癥反應的價值。

材料與方法

1.動脈粥樣硬化模型建立 (1)3～4 個月齡，五指山小型豬20 頭，雌雄不限(雄性已去勢)，體質量(29.29±1.25) kg(自中國農業(yè)科學院畜牧所)。五指山小型豬20 頭連續(xù)編號，高脂高膽固醇喂養(yǎng)(基礎飼料+6%膽固醇+10%豬油)飲食。小型豬每日分2 次飼喂為避免動物突然喂飼高脂飲食出現應激反應，飼料量為體質量的3%，采取喂飼高脂飲食與基礎飼料比逐漸增加的方法，10 d 后達到目標量。

(2)按照中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物管理規(guī)定執(zhí)行(55 號文件，2001)，高脂飲食飼養(yǎng)，實驗前24 h 禁食禁水。自達到目標量之日計算喂養(yǎng)4 周后，給予小型豬進行腹主動脈球囊拉傷術。以3%戊巴比妥納30 mg/ kg 給予小型豬麻醉。麻醉平穩(wěn)后經股動脈穿刺，用4 號穿刺針刺入動脈送入超滑導絲，造影下送入6F 直徑球囊導管，連接手推式壓力泵，將氣囊充氣自腹主動脈腎動脈水平(平腰3 ～4 椎體層面)向遠段牽拉至髂動脈，造影下可見被球囊擴張的血管局部明顯膨隆，每次30 s，間隔30 s，重復2～4 次，致腹主動脈內膜剝脫及機械損傷。撤出導管，按壓止血。術后連續(xù)3 d 給予肌注青霉素200 萬單位，以防止術后感染。

2.影像學檢查 (1)MR 成像方法：掃描前24 h禁食，仰臥體位，使用表面線圈。所有檢查在3.0T磁共振掃描儀 3.0 T (PhilipsAchieva，Best，the Netherlands)完成。線圈采用小動物專用表面相控振線圈。根據三維時間飛躍法血管成像(time-of-flight，TOF)(TR=21 ms； TE=2.9 ms； Flip angle=15°)判斷血管位置。而后對血管壁(平腰3-4 椎體層面)進行二維黑血多加權MR 成像，成像序列包括：軸位T1WI(TR=800 ms； TE=11 ms； ETL=10)；T2WI(TR=3 500 ms； TE=40 ms； ETL=12)。黑血動態(tài)增強(black blood dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，BB DCE-MRI) 掃描采用 T1WI FSPGR 序列(TR=750 ms； TE=12 ms； TI1=325 ms； TI2=125 ms，ETL=8)，矩陣 259×259；動態(tài)增強掃描相位數為15，掃描3 層面，層厚為3.4 mm。對比劑為馬根維顯(Bayer Schering Pharma AG，Berlin，Germany，0.05 mmol/kg)，經耳緣靜脈注射，注射速度為1 mL/s，隨后以同樣流率注射0.9%氯化鈉溶液20 mL。

(2)圖像處理和分析：由兩名經專業(yè)培訓的影像科醫(yī)生和影像學工程師閱讀分析圖像，應用分析軟件CASCADE(美國華盛頓大學自行研發(fā))[6]輔助完成。參與分析圖像的工作人員對小型豬信息保持未知(盲法)并采取意見統(tǒng)一原則。根據血管壁圖像質量評分標準，圖像質量低(imagingquality，IQ＜2)認為無法分析，予以排除(表1)。通過軟件，測量各層面管腔面積(lumen area，LA)、管壁面積(wall area，WA)、管壁標準化指數(normalize wall index，NWI)。計算血管壁容積傳輸常數(Ktrans)，血漿容積(Vp)，血管外細胞外容積(Ve)和曲線下面積(AUC)。

表1 圖像質量判定的詳細標準

圖1 MR 圖像和相關病理對照圖 A：DCE-MRI 掃描動脈粥樣硬化斑塊可見強化(白色箭頭)；B 和C：相應層面病理切片HE 染色顯示動脈粥樣硬化斑塊內新生血管(黑色箭頭)(B：HE 染色，×40；C：HE 染色，×100)

圖2 MR 圖像和相關病理免疫組化對照圖 A：DCE-MRI 掃描，管壁可見不均勻強化(白色箭頭)；B：IL6 免疫組化標記巨噬細胞，C：TNF 免疫組化標記巨噬細胞，棕色為陽性表達區(qū)域，藍紫色為細胞核(×400)

3.病理免疫組化分析 模型制備成功后于2周、16 周分別處死實驗動物以獲得不同的炎癥程度。取出腹主動脈至髂總動脈分叉處的主動脈，對掃描范圍內血管進行固定(0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，10%甲醛浸泡固定)。使用HE 染色觀察血管的形態(tài)及動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)。由于IL6 和TNF參與動脈粥樣硬化斑塊內的炎性反應，是巨噬細胞的主要介質[7]，免疫組化方法使用IL6 和TNF 染色標記動脈粥樣硬化斑塊內炎性細胞(巨噬細胞)。以細胞胞質內出現棕黃色顆粒且著色強度高于背景染色者判定為陽性。使用BA400 顯微鏡(攝像掃描裝置：Moticcam 2306)對病理切片進行掃描，利用Image-ProPlus5.0 圖像軟件分析，計數每張切片400倍高倍視野下斑塊內新生血管及巨噬細胞的數目。

4.統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析。利用Spearman 相關分析，與病理微血管及巨噬細胞數目對照。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.模型建立 15 頭五指山小型豬(15/20，75%)成功建立模型。死亡5 頭小型豬原因：球囊拉傷術前麻醉過量死亡2 頭；球囊拉傷術中誤吸死亡1 頭；球囊拉傷術后拉傷部位血栓形成致死2 頭。另3 頭建模成功的小型豬在建模后行磁共振掃描時(2 周 2 頭、16 周 1 頭)可疑藥物(對比劑)過敏死亡。與模型建立前水平對比，建模成功后小型豬體質量顯著增加[(29.29±1.25)vs.(46.86±6.87) kg，P=0.0007]。

2.影像與病理結果對照 與微血管數目比較發(fā)現，Ktrans 與其具有較好的相關性(r=0.913，P=0.0003，圖1)。與巨噬細胞數目相比，Ktrans 亦與其具有較好的相關性(r=0.781，P＜0.0001，圖2)。

3.影像結果 (1)模型建立前后血管形態(tài)學比較：與模型建立前比較發(fā)現，管腔變小[(72.35±10.72vs.(67.09±10.14) mm2，P=0.0003]，管壁增厚 [(1.10 ± 0.07)vs.(1.20 ± 0.13) mm2，P=0.0361]，標準化血管壁指數變大 [(0.0149 ±0.0019)vs.(0.0173±0.0018)，P＜0.0001，表2]。

(2)模型建立前后血管功能學比較：模型建立前、后比 較發(fā) 現，Ktrans [(0.0173 ± 0.0032)vs.(0.0307±0.0037)，P＜0.0001]、Vp[(0.0157±0.0041)vs.(0.0321±0.0122)，P= 0.0025]、Ve[(0.0988 ± 0.0229)vs.(0.1678 ± 0.0368)，P＜0.0001]，AUC[(11784±2013)vs.(18822±4948)，P=0.0057]數值均顯著增高(圖3)。

表2 模型建立前后血管形態(tài)學結果比較()

表2 模型建立前后血管形態(tài)學結果比較()

項目 模型建立前 模型建立后 P 值管腔(LA)/mm2 Max 76.83±9.76 71.49±8.68 0.0001 Min 67.12±7.66 61.82±8.32 0.0002 Mean 72.35±10.72 67.09±10.14 0.0003管壁(WA)/mm2 Max 1.19±0.08 1.39±0.14 0.0003 Min 0.80±0.06 0.91±0.08 0.0008 Mean 1.10±0.07 1.20±0.13 0.0361標準化血管壁指數(NWI)MaxNWI 0.0159±0.0028 0.0209±0.0037 0.0003 MeanNWI 0.0149±0.0019 0.0173±0.0018 ＜0.0001

討 論

易損斑塊與穩(wěn)定斑塊的增強曲線有很大不同，通過斑塊不同的MRI 強化方式，有助于判斷斑塊的易損性[8-10]。DCE-MRI 灌注強度的定量值不僅反映斑塊內新生血管中對比劑的強度，也同時包括了彌散至細胞外基質中的對比劑，從而引起對斑塊內的新生血管密度的過度評估，若將該定量指標應用于臨床，還需進行一系列相關實驗得出其可靠的校正系數[11-12]。

從DCE-MRI 的動力學模型中可以得到一些反映血液供應和通透性的參數[13]。在以往亮血DCEMRI 的研究表明，動脈粥樣硬化斑塊內的濃度變化使用藥代動力學模型進行分析所得到的灌注參數：分數血漿容量(fractional plasmavolume，Vp)與新生血管的面積相關[14]，而對比劑的轉移常數(transfer constant，Ktrans)與新生血管的通透性相關[14]。證明Vp 和Ktrans 能夠反應血管壁通透性和細胞外間隙，從而反映斑塊內的炎性反應。Ktrans 值越大，則新生微血管數量越多，炎癥反應越重[15]。然而，亮血DCE-MRI 對中重度的斑塊可以進行測量，而動脈粥樣硬化早期由于斑塊負荷沒有中重度的斑塊負荷程度重，從而限制了其使用[16]。

圖3 血管功能學比較圖 A-D：炎性指標血管壁容積傳輸常數(Ktrans)，血漿容積(Vp)，血管外細胞外容積(Ve)，曲線下面積(AUC)模型建立前后變化

相對于亮血 DCE-MRI 技術而言，黑血 DCEMRI 具有以下優(yōu)勢：①去除血流信號對管腔邊界的干擾；②較高的空間分辨率和信號噪聲比[17]。Haikun 等研究發(fā)現，對亮血及黑血技術進行比較，發(fā)現黑血技術對管壁增厚不明顯的血管可以測量Ktrans 指標，從而定量測量炎性反應的影像指標[17]。本研究使用新型黑血DCE-MRI，發(fā)現其檢測指標Krans 與新生微血管數目及巨噬細胞數目二者具有較好的相關性。新生微血管是動脈粥樣硬化易損斑塊的重要病理學標志之一，而斑塊內新生微血管的形成是由斑塊內的炎癥反應引起的[18-19]。有學說認為斑塊內新生微血管是巨噬細胞進入纖維帽和斑塊肩部的主要途徑，斑塊內的巨噬細胞、金屬蛋白酶與內彈性膜的破裂和纖維帽膠原纖維溶解，增加斑塊破裂和動脈血栓形成的風險[20-21]。處于活動期的動脈粥樣硬化斑塊新生微血管數目多，斑塊內的炎性反應水平高。斑塊炎性過程可以引起細胞外容積的增加和細胞內皮的通透性。新型黑血DCE-MRI 成像基于此特點，對比劑可以快速的進出斑塊細胞外的空間，顯像組織的微循環(huán)、灌注及毛細血管通透性的情況，有助于提高動脈粥樣硬化易損斑塊的檢出和病變程度[22-23]。而且，新型黑血DCE-MRI 可以監(jiān)測炎性反應的差異，可作為一種監(jiān)測動脈粥樣硬化炎性反應變化的無創(chuàng)性影像學指標。

本研究采用五指山小型豬的動脈粥樣硬化模型，其管腔內徑與人類的血管內徑接近，可模擬人類血管的動脈粥樣硬化。通過研究五指山小型豬模型建立前后血管形態(tài)學變化，發(fā)現與模型建立前比較，管腔變小，管壁增厚，標準化血管壁指數變大。這與人類動脈粥樣硬化的演變相一致，今后能夠作為人類動脈粥樣硬化研究的動物模型。

本研究不足之處在于實驗動物數量較少，動脈粥樣硬化模型建立及核磁共振掃瞄時時實驗動物病死率高。其原因主要包括實驗中麻醉過量死亡，誤吸死亡及血栓形成導致術后死亡。這些需在今后的模型建立中予以注意。另外，由于ktrans 所需的藥代動力學分析中的血管輸入函數無法直接測量，通過肌肉組織作為對照進行計算，有可能引入誤差。最近的LaBBI 技術[17]可以同時采集黑血和亮血圖像，有望可以獲得更高的精度。

總之，黑血動態(tài)增強MR 成像方法可以反映早期動脈粥樣硬化斑塊炎癥特征。并可以定量測量炎性反應的影像指標，為早期動脈粥樣硬化提供了一種無創(chuàng)的影像監(jiān)測手段。