王保，姚嘉茵，魯義，卿朝輝，勞俊銘，劉棟，邱桂華，堯新華*

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510130；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510655)

目前，糖尿病周圍神經(jīng)痛(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的發(fā)病機(jī)制未明，治療手段有限[1,2]。臨床上極其需要針對(duì)DPN的持續(xù)且有效的治療方法。獐牙菜苦苷(Swertiamarin)是中藥龍膽草的主要活性成分之一，新近研究表明獐牙菜苦苷可有效保護(hù)神經(jīng)，減緩神經(jīng)病理性疼痛[3]。但是由于其作用的具體機(jī)制尚不明確，影響了其在DPN鎮(zhèn)痛領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究基于炎性應(yīng)激反應(yīng)層面，旨在研究獐牙菜苦苷對(duì)DPN大鼠血清炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。SPF級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，由中山大學(xué)(北校區(qū))動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2017-0882。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度保持在(25±1) ℃，光/暗環(huán)境每12 h循環(huán)一次，相對(duì)濕度為(55±10)%。大鼠顆粒飲食配方：74%碳水化合物、21%蛋白質(zhì)和4%脂肪。

1.2 動(dòng)物模型的建立

采用鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma)腹腔注射法構(gòu)建DPN大鼠模型。大鼠實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，禁食12 h，腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)，48 h后測(cè)定大鼠尾靜脈血糖。血糖>16.7 mmol/L的大鼠為DPN模型組大鼠(經(jīng)熱輻射試驗(yàn)、冷板試驗(yàn)以及觸覺(jué)過(guò)敏試驗(yàn)均證實(shí)模型組大鼠存在肢體反應(yīng)潛伏期縮短、疼痛閾值下降等類似糖尿病周圍神經(jīng)痛的癥狀)。

1.3 動(dòng)物分組與處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為空白組、DPN組及獐牙菜苦苷組。對(duì)DPN組和獐牙菜苦苷組進(jìn)行DPN造模，造模后第7、14天，獐牙菜苦苷組按大鼠體質(zhì)量分別給予腹腔注射30 mg/kg獐牙菜苦苷(成都瑞芬思)；空白組與模型組分別腹腔注射30 ml/kg生理鹽水。造模后第14天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，所有大鼠麻醉下處死，取血加入抗凝管，離心后取上清液置于-70 ℃保存，用于檢測(cè)血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8以及抑炎因子IL-10、TGF-β的含量水平。

1.4 ELISA檢測(cè)

根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8，抑炎因子IL-10、TGF-β的水平。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

按照GenBank序列，用美國(guó)Invitrogen公司Vector NTI suite軟件核查并修改個(gè)別非配對(duì)堿基，交上海英俊生物工程公司合成，見(jiàn)表1。按Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)，使用美國(guó)Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0軟件，計(jì)算待測(cè)細(xì)胞因子的GAPDH的光密度比值。

1.6 免疫印跡檢測(cè)

使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠TNF-α、IL-6 、IL-8、IL-10、TGF-β蛋白表達(dá)，使用美國(guó)Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0軟件半定量分析。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血清炎性因子水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型組(P<0.05)；獐牙菜苦苷組TGF-β低于空白組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 血清炎性因子mRNA表達(dá)水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白組(P<0.05)，但兩組TGF-β比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 血清炎性因子蛋白表達(dá)水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白組(P<0.05)，兩組IL-8、TGF-β比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖1 3組大鼠血清炎性因子水平變化

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖2 3組大鼠血清炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖3 3組大鼠血清炎性因子蛋白水平表達(dá)

3 討論

糖尿病是威脅人類健康的三大慢性代謝性疾病之一，其中DPN發(fā)病率13%～26%，且逐年增長(zhǎng)。目前，DPN尚無(wú)徹底治愈甚至短期控制的有效方法，對(duì)患者及社會(huì)造成沉重的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4,5]。炎癥反應(yīng)在DPN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，有研究結(jié)果表明，TNF-α與DPN發(fā)病密切相關(guān)[6]。TNF-α的上調(diào)促進(jìn)了一系列下游炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和脫髓鞘，最終導(dǎo)致周圍神經(jīng)功能障礙。使用TNF-α抑制劑后則減輕了DPN大鼠的神經(jīng)損傷。除了TNF-α外，還存在許多炎癥因素參與DPN的進(jìn)程，包括IL-6、IL-8、IL-10及TGF-β。我們研究團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)，Toll-like受體(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制劑TAK-242減少氧化應(yīng)激、降低血糖水平，對(duì)DPN大鼠起治療作用，其機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)HGMB1/TLR4/MAPK信號(hào)通路，抑制促炎因子，促進(jìn)抑炎因子表達(dá)，糾正免疫紊亂。我們團(tuán)隊(duì)前期研究已驗(yàn)證免疫因素在DPN致病中的重要作用[7-10]。

炎性因子按照功能不同分為促炎因子與抗炎因子，促炎因子包括TNF-α、IL-6以及IL-8等，抑炎因子包括IL-10以及TGF-β等。正常生理情況下，促炎因子與抗炎因子互相作用維持機(jī)體炎性因子相對(duì)平衡[11]。而在病理狀態(tài)下，促炎因子與抗炎因子的平衡一旦被打破，將誘發(fā)炎性活動(dòng)及炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致慢性炎癥刺激引起神經(jīng)痛。因此，糾正炎性因子失衡是治療DPN的新靶點(diǎn)。

獐牙菜苦苷屬于新近出現(xiàn)的鎮(zhèn)痛藥物，現(xiàn)代學(xué)者對(duì)獐牙菜苦苷的藥理作用研究主要集中在鎮(zhèn)痛和保肝利膽方面[12]。研究表明獐牙菜苦苷可有效保護(hù)神經(jīng)，減緩病理性神經(jīng)疼痛[12-13]。其作用機(jī)制不明確。令我們關(guān)注的是，新近研究表明獐牙菜苦苷可調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體信號(hào)通路[14]，這可能是其糾正炎性因子失衡治療DPN中的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究獐牙菜苦苷對(duì)DPN大鼠血清炎性反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)采用STZ構(gòu)建DPN大鼠模型，因?yàn)?STZ無(wú)神經(jīng)毒性，適用于糖尿病相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的研究。實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA、RT-PCR以及免疫印跡三種方法檢測(cè)血清標(biāo)本，結(jié)果顯示DPN模型組促炎因子水平高于空白組、抑炎因子低于空白組，提示在DPN中確實(shí)存在炎性因子失衡的狀況。而炎性因子失衡將進(jìn)一步促進(jìn)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起慢性周圍神經(jīng)痛，這可能是DPN的致病因素之一。獐牙菜苦苷組促炎因子低于DPN模型組；抑炎因子均高于DPN模型組。提示獐牙菜苦苷可有效糾正DPN炎性因子失衡的狀況，減緩神經(jīng)病理性疼痛。獐牙菜苦苷組與空白組比較，部分炎性因子有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與獐牙菜苦苷干預(yù)的劑量和用藥持續(xù)時(shí)間相關(guān)，研究小組今后將繼續(xù)深入研究。

本研究結(jié)果表明獐牙菜苦苷可有效糾正DPN炎性因子失衡的狀況，減緩神經(jīng)病理性疼痛。其作用機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)抗炎因子表達(dá)，減少促炎因子表達(dá)，減少炎性因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。綜合以往研究結(jié)果，獐牙菜苦苷可以為DPN提供良好的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，有望成為治療DPN的新藥物。