李兆康 盧 青 丁世芳

目前，心肌缺血-再灌注損傷的機制仍未被完全闡明。自噬在缺血-再灌注過程中被上調(diào)，早期可能通過減少能量消耗和清除受損細胞器來保護心肌，而后期過度激活則對心肌有害，關于自噬在缺血-再灌注中的作用仍存在爭議[1]?？p隙連接蛋白43(Cx43)是心室肌中含量最高的縫隙連接蛋白，除了在細胞膜上，它還定位在線粒體內(nèi)膜上。線粒體Cx43參與線粒體呼吸鏈的調(diào)節(jié)，維持線粒體的穩(wěn)定；此外，其在缺血預處理和后處理對缺血-再灌注心肌的保護中起關鍵作用，但關于線粒體Cx43本身在缺血-再灌注中的變化和作用卻鮮見報道[2-3]。本研究通過建立H9c2細胞缺氧-復氧(H/R)模型，模擬心肌的缺血-再灌注過程，試圖探究自噬和線粒體Cx43 在這個過程中的變化和相互作用關系，以期為臨床防治缺血-再灌注損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞系H9c2(2-1)購自中國科學院上海細胞庫。FBS、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，格爾德霉素(GA)購自APExBIO公司，3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自美國Sigma公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、細胞線粒體分離試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自上海碧云天生物技術有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔多克隆抗體GAPDH購自杭州賢至生物有限公司，兔多克隆抗體Beclin-1、兔多克隆抗體coxⅣ均購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔多克隆抗體LC3A/B購自美國Affinity品牌，兔多克隆抗體Cx43、兔多克隆抗磷酸化Cx43(p-Cx43)抗體均購自美國Cell Signaling公司，羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細胞培養(yǎng) 用含10%血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)在37 ℃，二氧化碳(CO2)、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中對H9c2細胞進行培養(yǎng)。待細胞密度達80%以上，用0.25%胰酶消化傳代，24 h后換液，48～72 h后再進行傳代。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞H/R模型建立 用不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基替換原有的完全培養(yǎng)基，將H9c2細胞置于37 ℃，CO2、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的缺氧培養(yǎng)箱中缺氧處理12 h后，將培養(yǎng)基重新更換為完全培養(yǎng)基并置于37 ℃，CO2、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中復氧處理12 h。

1.2.3 分組 將H9c2細胞分為5組：對照組正常培養(yǎng)；另4組為處理組，分別為H/R組細胞按1.2.2方法進行H/R處理。GA組用含GA(1 μmol/L)的完全培養(yǎng)基在37 ℃，CO2、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中預處理30 min，再按1.2.2方法進行H/R處理；3-MA組用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基缺氧處理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培養(yǎng)基復氧處理12 h；GA+3-MA組用含GA(1 μmol/L)的完全培養(yǎng)基在37 ℃，CO2、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中預處理30 min，接著用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基缺氧處理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培養(yǎng)基復氧處理12 h。

1.2.4 LDH活性檢測 將H9c2細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板上，對照組和H/R組各8個復孔，收集每孔的培養(yǎng)液，按照LDH試劑盒說明書檢測兩組LDH活性。

1.2.5 CCK-8檢測細胞活力 將5組H9c2細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板上，每組8個復孔。另設空白組，只加培養(yǎng)液不加細胞。每孔加入10 μL CCK-8溶液(起始培養(yǎng)基為100 μL)，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為0.05的培養(yǎng)箱中孵育1 h。孵育結束后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(A450)。將對照組細胞活力定義為100%，處理組細胞活力(%)=(處理組-空白組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.6 JC-1法檢測線粒體膜電位 將H9c2細胞按(2～5)×105/孔的密度接種于6孔板上，每組3個復孔。用0.25%胰酶消化、離心后加完全培養(yǎng)基重懸。加0.5 mL JC-1染色工作液在37 ℃，CO2、氧氣體積分數(shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結束后130×g、4 ℃離心3 min，棄上清液。用JC-1染色緩沖液重懸細胞，在130×g、4 ℃離心3 min，棄上清液，該步驟重復2次后加500 μL JC-1染色緩沖液重懸，應用流式細胞儀分析。線粒體膜電位高時JC-1聚合物呈紅色熒光，線粒體膜電位低時JC-1單體呈綠色熒光，以綠色熒光百分比(線粒體膜電位降低細胞百分比)表示線粒體膜電位的下降程度。

1.2.7 Western印跡法檢測蛋白質(zhì)水平 提取各組心肌細胞的總蛋白質(zhì)，利用細胞線粒體分離試劑盒提取各組細胞中的線粒體蛋白質(zhì)，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白質(zhì)定量檢測。每孔40 μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉的TBST(Tris-HCl和吐溫-20)緩沖液室溫封閉2 h后(磷酸化蛋白質(zhì)用1%～3%的牛血清白蛋白封閉)，分別放入抗coxⅣ一抗(1∶5 000)、抗GAPDH、Cx43和p-Cx43一抗(1∶1 000)、抗Beclin-1和LC3B一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜5～6次，每次5 min，加入HRP標記二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h。TBST緩沖液洗膜5～6次，每次5 min，ECL顯影，采集圖像。Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ以GAPDH為內(nèi)參，線粒體Cx43和p-Cx43以coxⅣ為內(nèi)參，用目的蛋白質(zhì)灰度/內(nèi)參灰度表示蛋白質(zhì)相對表達量。

1.2.8 電子顯微鏡(簡稱電鏡)觀察自噬體 將H9c2細胞按(2～5)×105/孔的密度接種于6孔板上，每組2個復孔。吸除原培養(yǎng)液，加入2.5%戊二醛固定2 h后用細胞刮刮下細胞，320×g、離心5 min，2.5%戊二醛重懸，透射電鏡觀察自噬體。

2 結 果

2.1 H9c2心肌細胞H/R模型的建立 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，H/R組漂浮的死細胞較多、細胞密度降低，見圖1。H/R組的細胞活力為(85.14±9.01)%，顯著低于對照組的(100.00±0)%(P<0.01)。H/R 組胞培養(yǎng)液中LDH水平為(163.20±7.26) U/L，顯著高于對照組的(130.25±24.31) U/L(P<0.01)。H9c2細胞H/R模型成功建立。

2.2 各組自噬體及其相關蛋白質(zhì)水平的比較 與對照組相比，H/R組的自噬體明顯增多，內(nèi)含被吞噬的線粒體等結構；GA組、3-MA組、GA+3-MA組的自噬體均較H/R組明顯減少，其中GA組可見大量腫脹的線粒體， GA+3-MA 組細胞器損傷嚴重、結構模糊，見圖2。 經(jīng)Western印跡法檢測，H/R組自噬相關蛋白質(zhì)Beclin-1水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均顯著高于對照組(P值均<0.05)，GA組、3-MA組、GA+3-MA組的Beclin-1蛋白質(zhì)水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均顯著低于H/R組(P值均<0.05)，GA+3-MA組的Beclin-1蛋白質(zhì)水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)，見圖3、表1。

A 對照組 B H/R組圖1 對照組和H/R組H9c2心肌細胞的形態(tài)學變化(×100)

A 對照組 B H/R組 C GA組 D 3-MA組 E GA+3-MA組圖2 透射電鏡下觀察各組細胞內(nèi)的自噬體(×5 000)

1 對照組 2 H/R組 3 GA組 4 3-MA組 5 GA+3-MA組圖3 Western印跡法檢測各組H9c2心肌細胞中 Beclin-1和LC3B蛋白質(zhì)表達結果

2.3 各組線粒體膜電位的比較 圖4中右下象限代表綠色熒光所占百分比，比較各組線粒體膜電位下降程度發(fā)現(xiàn)，H/R組和對照組的線粒體膜電位分別下降(14.45±0.84)%和(7.34±0.75)%，H/R組的線粒體膜電位顯著低于對照組(P<0.05)；GA組、3-MA組和GA+3-MA組的線粒體膜電位分別下降(27.87±1.68)%、(22.76±1.55)%和(38.88±1.41)%，其線粒體膜電位均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的線粒體膜電位顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)。

組別Beclin-1LC3BⅡ/LC3BⅠ對照0.26±0.030.77±0.09H/R0.89±0.05①4.37±0.50①GA0.75±0.06②③3.29±0.18②③3-MA0.47±0.03②③1.37±0.09②③GA+3-MA0.31±0.02②0.85±0.14②

與對照組比較：①P<0.05；與H/R組比較：②P<0.05；與GA+3-MA組比較：③P<0.05

A 對照組 B H/R組 C GA組 D 3-MA組 E GA+3-MA組圖4 各組H9c2心肌細胞中線粒體膜電位的流式細胞術檢測結果

2.4 各組線粒體Cx43蛋白質(zhì)水平的比較 H/R組的線粒體Cx43和p-Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于對照組(P值均<0.05)，GA組、GA+3-MA組的線粒體Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于H/R組(P值均<0.05)，GA組、3-MA組、GA+3-MA組的線粒體p-Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的線粒體p-Cx43蛋白質(zhì)水平分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)，見圖5、表2。

1 對照組 2 H/R組 3 GA組 4 3-MA組 5 GA+3-MA組圖5 Western印跡法檢測各組H9c2心肌細胞中線粒體Cx43和p-Cx43蛋白質(zhì)表達結果

組別Cx43p-Cx43對照0.86±0.020.58±0.01H/R0.75±0.03①0.41±0.03①GA0.62±0.09②0.27±0.06②③3-MA0.72±0.040.33±0.05②③GA+3-MA0.59±0.07②0.18±0.04②

與對照組比較：①P<0.05；與H/R組比較：②P<0.05；與GA+3-MA組比較：③P<0.05

2.5 各組細胞活力的比較 H/R組的細胞活力為(91.94±4.77)%，顯著低于對照組的(100.00±0)%(P<0.05)；GA組[(79.16±7.96)%]、3-MA組[(49.66±10.65)%]、GA+3-MA組[(40.45±3.59)%]的細胞活力均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的細胞活力分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)。

3 討 論

本研究中H9c2細胞在經(jīng)歷H/R后，細胞死亡增多、密度降低，細胞活力下降，LDH水平上升，表明H9c2心肌細胞H/R模型建立成功。

Beclin-1是再灌注階段調(diào)控自噬活動的關鍵因子，LC3B參與自噬體的延伸，LC3B Ⅰ轉變成LC3B Ⅱ并定位在自噬體膜上是自噬體形成的標志，檢測Beclin-1蛋白質(zhì)表達水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ值可反映自噬水平。本研究進一步經(jīng)電鏡觀察自噬體的結果顯示，與對照組相比，H/R組Beclin-1水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ均升高，電鏡下見H/R組自噬體增多，表明H/R引起心肌細胞自噬活動增加，這與既往報道一致。與H/R組相比，3-MA組的線粒體膜電位和細胞活力均下降，表明3-MA抑制自噬,細胞的損傷和死亡增多，提示自噬對H/R心肌細胞有保護作用。

缺血-再灌注會導致心肌細胞膜上Cx43的重構，包括數(shù)量、分布和磷酸化狀態(tài)的改變，并造成心律失常易感性的增加[4-5]，而對線粒體上的Cx43蛋白，有研究顯示，在經(jīng)歷90 min缺血后豬心肌中線粒體Cx43含量增加，考慮與其降解被抑制有關[6]。近期的研究[7]發(fā)現(xiàn)，通過CoCl2誘導H9c2心肌細胞缺氧3和6 h均引起線粒體Cx43水平明顯升高，線粒體Cx43對缺氧心肌細胞有保護作用。本研究中，經(jīng)歷H/R過程后，H9c2細胞中線粒體Cx43總含量下降，且p-Cx43下降的幅度更大，說明復氧過程引起線粒體Cx43含量的下降，并造成線粒體Cx43的脫磷酸化。線粒體Cx43的磷酸化狀態(tài)對維持線粒體結構和功能的穩(wěn)定有重要意義[8-9]，推測線粒體Cx43含量下降和脫磷酸化可能是再灌注損傷發(fā)生的重要機制。GA是熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑，作為一種抗腫瘤藥物被廣泛研究，它可引起腫瘤細胞線粒體通透性增加、膜電位下降，以及細胞色素C釋放，最終導致腫瘤細胞凋亡[10]。研究[3]結果表明，GA抑制HSP90介導的Cx43向線粒體膜轉運，從而消除缺氧后處理對H/R心肌的保護作用。本研究利用GA抑制Cx43向線粒體內(nèi)膜的轉運發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，GA組線粒體Cx43和p-Cx43水平進一步降低，并引起線粒體膜電位和細胞活力的下降，證實了線粒體Cx43及其磷酸化狀態(tài)的維持對H/R心肌的保護有重要作用。

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，自噬參與細胞膜上Cx43的降解，而在營養(yǎng)缺乏時Cx43的內(nèi)吞和降解則可導致自噬的增加[13]，但自噬與線粒體Cx43間的關系鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，3-MA組線粒體p-Cx43明顯減少，但線粒體Cx43水平的差異無統(tǒng)計學意義，表明抑制自噬后線粒體Cx43脫磷酸化增多，自噬對線粒體Cx43磷酸化的維持起重要作用。進一步比較GA+3-MA組與GA組的線粒體Cx43、p-Cx43水平，更加說明這一問題。本研究還發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，GA組線粒體Cx43、p-Cx43均較少，自噬水平明顯下降；與3-MA組相比，GA+3-MA組線粒體Cx43總量無明顯變化，而線粒體p-Cx43減少，自噬活性進一步降低，表明線粒體Cx43特別是p-Cx43可能是自噬激活信號通路中的重要一環(huán)。此外，通過比較各組線粒體膜電位和細胞活力發(fā)現(xiàn)，GA+3-MA組的線粒體膜電位和細胞活力下降最為顯著，表明自噬與線粒體Cx43對心肌細胞的保護有協(xié)同作用。

綜上所述，自噬參與線粒體Cx43磷酸化狀態(tài)的維持，線粒體Cx43特別是p-Cx43也參與了自噬的激活過程，它們對H/R心肌起保護作用。靶向上調(diào)自噬水平與線粒體Cx43含量，改善線粒體Cx43磷酸化狀態(tài)，可能成為今后治療心肌缺血-再灌注損傷的重要手段。