郭彩茹 亓民 牛宇杰 王琛琛

胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)通過采集孕婦外周血，提取總游離DNA，采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物學(xué)信息分析，計(jì)算出胎兒游離 DNA(cell-freefetal DNA，cffDNA)相對(duì)含量，得出胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)率。由于不需要進(jìn)行創(chuàng)傷性取樣，具有高敏感性和高特異性，已越來越受到臨床的重視[1]，它能使胎兒21-三體綜合征檢出率達(dá)到 99%[2-3]，作為一種新的、近似于診斷水平[4]的篩查胎兒染色體非整倍體技術(shù)應(yīng)用于臨床。本文通過對(duì)在本院接受NIPT 的697例高危孕婦的檢查結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，以探討NIPT在診斷高危孕婦胎兒染色體非整倍體疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

1. 一般資料：選擇2014年5月—2017年7月，在本院產(chǎn)科門診確定為高危孕婦697例，孕婦年齡19～45歲，平均年齡(33.0±5.3)歲。高危因素為高齡孕婦(預(yù)產(chǎn)期年齡>35歲)355例占50.9%、唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)225例占32.3%、唐氏綜合征血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)86例占12.3%，既往有不良孕產(chǎn)史31例占4.4%。孕周 12～28 周，均為單胎，進(jìn)行NIPT。唐氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)值≥1/270，臨界風(fēng)險(xiǎn)1/270～1/1000，低風(fēng)險(xiǎn)<1/1000。18-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)值≥1/350，臨界風(fēng)險(xiǎn)1/350～1/1000，低風(fēng)險(xiǎn)<1/1000。采用統(tǒng)一知情同意書，充分告知孕婦 NIPT 的臨床適應(yīng)征、檢測(cè)范圍、局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)[5]，由孕婦自愿選擇并簽署知情同意書。

2. 方法：(1)孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)。采集孕婦外周血10 ml于Streck采血管中，由廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心按SOP 文件使用DNA提取試劑盒(達(dá)安基因)提取血漿中游離DNA，利用文庫構(gòu)建試劑盒(達(dá)安基因)構(gòu)建DNA文庫，將構(gòu)建好的文庫樣品通過熒光定量PCR儀進(jìn)行文庫定量。利用第2代測(cè)序儀DA8600進(jìn)行上樣和測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得出胎兒發(fā)生染色體非整倍體疾病的風(fēng)險(xiǎn)率。(2)結(jié)果驗(yàn)證及隨訪。對(duì)NIPT結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)者，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，進(jìn)行B超引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 ml，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后，常規(guī)制備染色體經(jīng)G顯帶后染色體核型分析。對(duì)NIPT結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦隨訪妊娠結(jié)局及胎兒出生后的情況。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用 SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1. 孕婦NIPT結(jié)果：高危孕婦共 697例，NIPT結(jié)果為非染色體整倍體疾病高風(fēng)險(xiǎn)者共 12例：21-三體綜合征 7例，18-三體綜合征 4例，13-三體綜合征 1例。其中高齡組355例，檢出21三體綜合征3例(0.8%)，18三體綜合征2例(0.6%)，13三體綜合征1例(0.3%)，共檢出高風(fēng)險(xiǎn)者6例(1.7%)；唐氏綜合征血清學(xué)篩查高危組225例，檢出21三體綜合征4例(1.8%)，18三體綜合征1例(0.4%)，共檢出高風(fēng)險(xiǎn)者5例(2.2%)。唐氏綜合征血清學(xué)篩查臨界組86例，檢出18三體1例(1.2%)，不良孕產(chǎn)史組未檢出高風(fēng)險(xiǎn)患者。見表 1。

2. 孕婦NIPT檢測(cè)結(jié)果與羊水染色體核型分析結(jié)果比較：對(duì)于12例無創(chuàng)檢測(cè)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)者，均進(jìn)行了羊水染色體核型分析。經(jīng)分析，NIPT技術(shù)對(duì)于胎兒非整倍體染色體疾病與羊水穿刺染色體核型分析技術(shù)陽性符合率為100%。見表 2。陽性患者均終止妊娠，NIPT結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)者685例，經(jīng)隨訪，截至 2018 年6月31日新生兒均已出生，家屬自述均正常。

3.高齡組孕婦年齡與染色體非整倍體疾病的關(guān)系：參與研究的高齡孕婦共355例，其中孕婦年齡35～39歲，292(82.3%)例，胎兒染色體非整倍體疾病發(fā)生率為1.0%(3/292)；孕婦年齡>40歲，63(17.7%)例，胎兒染色體非整倍體疾病發(fā)生率為6.3%(4/63)；(見表3)。孕婦年齡>40歲，胎兒染色體疾病發(fā)病率高于35～39歲組(χ2=7.593，P=0.06)。

表1 高危孕婦NIPT結(jié)果分析[n(%)]

表2 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果比較

表3 孕婦年齡與染色體疾病發(fā)生率的關(guān)系[n(%)]

注：與年齡35～39歲組比較，P=0.06

討論

隨著我國二胎政策的放開，高齡孕婦和唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)人數(shù)不斷增加，如何采取更有效的方法來提高染色體非整倍體疾病的檢出率并減少不必要的有創(chuàng)操作是目前臨床上急需解決的問題。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，包括絨毛穿刺、羊水穿刺、臍血穿刺，具有染色體核型分析高準(zhǔn)確率的優(yōu)點(diǎn)，且能分析出除了染色體數(shù)目異常外的結(jié)構(gòu)異常，為產(chǎn)前診斷的臨床金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但是取樣時(shí)卻存在0.5%～2%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，容易導(dǎo)致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產(chǎn)等并發(fā)癥。而無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)具有高準(zhǔn)確性、無創(chuàng)傷性等優(yōu)點(diǎn)且有效降低了侵入性操作引起的流產(chǎn)、感染等風(fēng)險(xiǎn)，易被孕婦接受，同時(shí)其適用于孕 12～26周，克服了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)在取材以及檢測(cè)時(shí)間等方面的缺陷和限制，可廣泛應(yīng)用于臨床。

對(duì)本資料提供的697 例唐氏高危孕婦進(jìn)行NIPT，并對(duì)高?；颊哌M(jìn)行胎兒羊水染色體核型分析。結(jié)果表明孕婦外周血游離胎兒 DNA 檢測(cè)技術(shù)與羊水染色體核型分析的陽性符合率為100%，本文NIPT對(duì)唐氏綜合征檢出率高于報(bào)道的99%[3,6-7]，未出現(xiàn)假陽性、假陰性可能是因?yàn)闃颖緮?shù)量有限，需要進(jìn)一步積累樣本。胎兒13-三體綜合征的發(fā)病率低，約為 1∶25000[8]，本研究13-三體綜合征檢出1例。說明無創(chuàng)DNA 檢測(cè)技術(shù)可以作為傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的有效輔助手段[9]。但對(duì)于非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)異常的確診仍需通過羊水或臍帶血進(jìn)行染色體核型分析。

孕婦年齡35～39歲胎兒染色體非整倍體疾病發(fā)病率為1.0%(3/292)，孕婦年齡>40歲胎兒染色體非整倍體疾病發(fā)病率升高到6.3%(4/63)。結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致[10]。近幾年隨著生育年齡的推遲和二胎政策的放開，因年齡因素直接做產(chǎn)前診斷的孕婦逐漸增多。傳統(tǒng)的羊膜腔穿刺會(huì)有0.5%～1%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)于高齡孕婦也是一個(gè)顧慮。近年來新發(fā)展的孕婦外周血游離DNA高通量測(cè)序技術(shù)，已被臨床研究證實(shí)在檢測(cè)染色體非整倍體疾病方面的敏感度和特異度與傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)有較高的一致性[11]，這種無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)作為傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)的補(bǔ)充，可以解決目前產(chǎn)前診斷技術(shù)力量不足的問題，也將會(huì)是以后產(chǎn)前篩查和診斷體系的發(fā)展方向。