徐雅琴，杜明陽(yáng)，楊 露，劉育松，魏 紅，鄭彬浩，郭瑩瑩，楊 昱*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑加侖別名黑穗醋栗，其果實(shí)富含多種維生素、糖類(lèi)、有機(jī)酸和花青素等。研究發(fā)現(xiàn)，黑加侖果實(shí)不僅是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的水果，而且具有多種保健功效，如具有改善視功能、降血脂和降血壓等功效[1-2]。多糖是黑加侖果實(shí)主要活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗糖化等作用[3-4]。研究表明，天然多糖的生物活性受到其分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)特征的影響[5-6]。本課題組前期制備得到的黑加侖果實(shí)多糖大多具有較大的分子質(zhì)量，水溶性差，一定程度上影響了多糖的生物活性[7-8]。因此，選擇適宜的方法對(duì)黑加侖果實(shí)多糖進(jìn)行降解，制備不同低分子質(zhì)量多糖，可為篩選高活性黑加侖果實(shí)多糖提供依據(jù)。

超聲波作為一種綠色高效的降解方法，具有操作簡(jiǎn)單、可控性好的特點(diǎn)，其在食品和醫(yī)藥工業(yè)中用于多糖的降解引起了廣泛的關(guān)注[9-10]。超聲波引發(fā)的多糖降解是由超聲空化（機(jī)械效應(yīng)）引起的。超聲波處理誘導(dǎo)液體介質(zhì)內(nèi)部空化氣泡的快速形成和坍塌，產(chǎn)生強(qiáng)烈的壓力使多糖分子中共價(jià)鍵斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致多糖的降解[8]。與化學(xué)降解和熱降解不同，超聲波降解是一個(gè)非隨機(jī)過(guò)程，其引起的壓力一般發(fā)生在分子的中心，并從內(nèi)向外輻射[10-11]。研究表明超聲不僅可以改變多糖的理化性質(zhì)（分子質(zhì)量、黏度、溶解度和流變性等），還可以提高多糖的生物活性，如抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗炎活性[5-6,9-10]等。例如，Yan Jingkun等發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲波處理能夠在短時(shí)間內(nèi)降低桑黃菌絲多糖特性黏度和分子質(zhì)量，而一級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有變化，同時(shí)降解多糖具有更高的羥自由基清除能力和總抗氧化能力[5]。Du Bin等利用超聲波降解Schizophyllum commune菌絲胞外多糖，結(jié)果表明，與原多糖相比，降解多糖分子質(zhì)量和黏度降低，抗炎活性顯著提高[6]。目前，關(guān)于超聲降解對(duì)黑加侖果實(shí)多糖的性質(zhì)和生物活性影響的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)利用超聲波處理黑加侖果實(shí)多糖，制備兩種不同分子質(zhì)量多糖，對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)初步特征和體外生物活性進(jìn)行研究，以期為探究黑加侖果實(shí)多糖構(gòu)效關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖（Ribes nigrum L.）為‘布勞德’成熟果實(shí)，由黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站提供，－20 ℃冰箱真空密封冷藏備用。

木瓜蛋白酶 北京奧博星生物科技有限公司；果膠酶 上海藍(lán)季生物科技有限公司；D4006型大孔吸附樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠；大豆卵磷脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ-7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；UV-2700雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；振動(dòng)黏度計(jì) 日本Sekonic公司；FTS135型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果實(shí)多糖的制備

根據(jù)課題組已探究的復(fù)合酶法制備多糖：黑加侖果實(shí)勻漿加入去離子水中，料液比為1∶20，加入木瓜蛋白酶0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、果膠酶0.15%，50 ℃下水浴振蕩50 min，然后沸水浴10 min后抽濾、濃縮，用3 倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，粉紅色沉淀即為粗多糖。參考文獻(xiàn)[8]的方法，使用D4006型大孔樹(shù)脂對(duì)粗多糖溶液進(jìn)行純化。所得多糖溶液流水透析（截留分子質(zhì)量為3 500 Da）48 h。將透析后的多糖溶液進(jìn)行離心、濃縮、冷凍干燥，得到初步純化的多糖樣品，命名為原多糖（BFPs）。

1.3.2 黑加侖果實(shí)降解多糖的制備

利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)BFPs溶液（5.0 mg/mL）進(jìn)行降解。脈沖模式（開(kāi)1 s、關(guān)1 s），超聲溫度不高于50 ℃，超聲功率固定為700 W，降解時(shí)間分別為15 min和30 min。降解后多糖溶液經(jīng)透析（截留分子質(zhì)量為3 500 Da，48 h）、濃縮、冷凍干燥，得到兩種降解多糖UM-15和UM-30。

1.3.3 超聲降解對(duì)黑加侖果實(shí)多糖理化性質(zhì)的影響

1.3.3.1 黏均分子質(zhì)量

分別配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的原多糖和降解多糖溶液，利用烏氏黏度法[5]測(cè)定其特性黏度[η]，代入Mark-Houwink方程：lg[η]＝0.314 6 lg Mv－0.190 7，即可得到降解前后黑加侖多糖的黏均分子質(zhì)量（Mv）。

本實(shí)驗(yàn)Mark-Houwink方程確定方法如下：根據(jù)適合測(cè)定多糖Mv的Mark-Houwink非線性方程[η]＝KMvα，得到公式lg[η]＝lg K＋αlg Mv，式中：[η]為特性黏度，Mv為黏均分子質(zhì)量，K為比例常數(shù)，α為經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。

通過(guò)測(cè)定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（T-40、T-110、T-500、T-2000）特性黏度[η]，以lg[η]-lg Mv作圖，所得曲線斜率即為α值，截距即為lg K。

1.3.3.2 振動(dòng)黏度

分別配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的原多糖和降解多糖溶液，使用振動(dòng)黏度計(jì)測(cè)量其振動(dòng)黏度。

1.3.3.3 溶解度

參考Chen Jialun等的方法[12]，并稍加修改。取多糖樣品200 mg溶于5 mL的去離子水中，在室溫下振蕩攪拌24 h?；旌衔? 000 r/min離心30 min，然后將上清液除去。將剩余不溶物烘干，稱(chēng)質(zhì)量。以上步驟每個(gè)樣品重復(fù)3 次。溶解度按公式（1）計(jì)算。

1.3.3.4 組分分析

采用苯酚-硫酸法[13]測(cè)定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用二硝基水楊酸法[14]測(cè)定還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，采用咔唑-硫酸法[15]測(cè)定糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用福林-酚法[17]測(cè)定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 超聲降解對(duì)黑加侖果實(shí)多糖結(jié)構(gòu)的影響

1.3.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，對(duì)多糖BFPs，UM-15和UM-30在4 000～500 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描。

1.3.4.2 剛果紅實(shí)驗(yàn)

參考Xu Yaqin等的方法[18]，將BFPs、UM-15和UM-30與剛果紅試劑分別配制成一系列不同NaOH濃度的反應(yīng)體系，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，測(cè)定溶液的最大吸收波長(zhǎng)。用去離子水代替多糖溶液作為空白對(duì)照組。

1.3.4.3 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)

向試管中加入2.0 mL多糖溶液（2.0 mg/mL），加入2 mL H2O，再加入1.2 mL碘-碘化鉀試劑（含0.02%（體積分?jǐn)?shù)，后同）I2的0.2% KI溶液），振蕩混勻后，室溫下在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.3.5 超聲降解對(duì)黑加侖果實(shí)多糖生物活性的影響

參照文獻(xiàn)[1 9]的方法，配制質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的多糖溶液，測(cè)定多糖的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·清除率。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5.2 抗脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)

試液的配制：300 mg大豆卵磷脂超聲輔助溶解于30 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L、pH 7.4）中，得到脂質(zhì)體PBS分散系（lecithin liposome system，LLS）。將15.00 g三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、0.37 g硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、2.10 mL濃鹽酸依次加入100.0 mL水中，得到TCA-TBA-HCl混合液。

抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定方法參照Yang Dong等的方法[20]并作稍許改動(dòng)，分別于試管中加入1.0 mL LLS、1.0 mL 0.4 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品并混合均勻。在避光條件下37 ℃水浴60 min，之后加入2.0 mL TCA-TBA-HCl混合液，并于100 ℃水浴15 min，立即冷卻，以3 000 r/min離心10 min，取上清液在535 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度As?？瞻滓?.0 mL去離子水代替1.0 mL樣品，操作方法同上，可測(cè)得空白的吸光度Ac，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按公式（2）計(jì)算抑制率。

式中：Ac為不加多糖樣品溶液的脂質(zhì)氧化體系的吸光度；As為加多糖樣品溶液的脂質(zhì)氧化體系的吸光度。

式中：A0為不加多糖樣品溶液的吸光度；Aa為加入多糖樣品溶液的吸光度；Ab為多糖溶液本身的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0軟件作圖，并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（單因素方差分析法），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑加侖多糖的理化性質(zhì)

由表1可知，隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，多糖的Mv顯著降低（P＜0.05），降解15 min時(shí)，Mv減少56.97%，降解時(shí)間延長(zhǎng)到30 min時(shí)，Mv減少65.94%。同樣地，在超聲降解時(shí)間分別為15 min和30 min時(shí)，其振動(dòng)黏度分別降低了11.86%和16.49%。顯然，在一定范圍內(nèi)，延長(zhǎng)超聲作用時(shí)間，會(huì)提高多糖的降解程度。此結(jié)果與Hu Jielun等的研究結(jié)果[22]一致。該研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理可以顯著降低車(chē)前子種子多糖的分子質(zhì)量和黏度等。溶解度測(cè)定結(jié)果表明，利用超聲波處理黑加侖多糖可以顯著增加樣品的溶解度（P＜0.05）。超聲處理15 min后，多糖的溶解度增加了27.97%。當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至30 min時(shí)，UM-30的溶解度增加了61.53%。這可能是由于大分子質(zhì)量多糖的解聚并伴隨著較短聚合鏈比例的增加，導(dǎo)致降解多糖的水合趨勢(shì)增強(qiáng)和鏈間氫鍵數(shù)量減少[12]。

表1 多糖BFPs、UM-15和UM-30的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of BFPs, UM-15 and UM-30

此外，由表1可知，經(jīng)過(guò)初步純化后的多糖BFPs已經(jīng)不含蛋白質(zhì)和多酚。降解多糖UM-15和UM-30與BFPs的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不存在顯著差異。但是，還原糖和糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05），且呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加說(shuō)明超聲波處理使多糖糖鏈發(fā)生斷裂，多糖分子質(zhì)量降低。而超聲波處理后多糖中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加可能是超聲波處理使位于多糖內(nèi)部更多的糖醛酸暴露出來(lái)所致[23]。

2.2 黑加侖多糖的結(jié)構(gòu)初步表征

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖1 BFPs、UM-15和UM-30的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of BFPs, UM-15 and UM-30

由圖1可以看出，BFPs及UM-15、UM-30均具有多糖的特征吸收且特征吸收峰位置基本相同，說(shuō)明降解前后多糖分子的主要官能團(tuán)沒(méi)有變化。在3 400 cm－1處的峰為羥基O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 907 cm－1附近的峰為C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 730 cm－1附近的峰為酯化羰基C=O伸縮振動(dòng)，1 603 cm－1附近的峰為羧基C=O的伸縮振動(dòng)峰，此外1 430 cm－1處的吸收峰說(shuō)明BFPs、UM-15和UM-30中均含有糖醛酸，在1 200～1 000 cm－1處存在的吸收峰說(shuō)明降解前后多糖均為吡喃糖結(jié)構(gòu)[4]。綜上可知，超聲波作用于黑加侖果實(shí)多糖后并沒(méi)有改變基本結(jié)構(gòu)。

2.2.2 剛果紅實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

圖2 不同NaOH濃度下多糖與剛果紅絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)λmaxFig. 2 Maximum absorption wavelength of Congo red and Congo red-polysaccharides at various concentrations of NaOH

由圖2可以看出，隨著NaOH溶液濃度從0增大到0.5 mol/L，多糖BFPs及UM-15、UM-30與剛果紅試劑作用產(chǎn)生絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。最大吸收波長(zhǎng)的連續(xù)下降可能是因?yàn)槎嗵窃谒芤褐袨闊o(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，且越來(lái)越多的氫鍵被堿性溶液破壞[24]。3 種多糖在水溶液中具有無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，可能歸因于這些多糖較大的分子質(zhì)量和復(fù)雜的單糖組成[25]。Mao等指出雜多糖不能形成三螺旋結(jié)構(gòu)[26]。因此UM-15、UM-30和BFPs都不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2.3 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

圖3 多糖BFPs及UM-15、UM-30的碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 3 Ultra violet-visible absorption spectra of BFPs, UM-15 and UM-30 reaction with iodine-potassium iodide

如圖3所示，多糖BFPs及UM-15、UM-30與碘-碘化鉀試劑的反應(yīng)液在350 nm波長(zhǎng)處均有強(qiáng)吸收峰，在565 nm波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收峰，這說(shuō)明多糖BFPs、UM-15和UM-30均具有復(fù)雜的鏈狀結(jié)構(gòu)，其側(cè)鏈較長(zhǎng)、支鏈較多[27]。綜上可知，超聲波并未改變黑加侖果實(shí)多糖的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。

2.3 黑加侖多糖的體外生物活性

2.3.1 清除DPPH自由基和O2－·能力

由圖4、5可知，多糖BFPs、UM-15和UM-30在質(zhì)量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基和O2－·的清除作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)關(guān)系，且不同多糖清除自由基能力呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。在最大實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度（1.2 mg/mL）時(shí)，BFPs、UM-15和UM-30的DPPH自由基清除率達(dá)到最大值，分別為（85.02±2.32）%、（87.26±1.68）%、（9 0.1 8±0.6 6）%，低于V C的最大清除率（96.97±2.51）%，BFPs、UM-15、UM-30和VC的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.269、0.228、0.207 mg/mL和0.031 mg/mL。同時(shí)，BFPs、UM-15、UM-30和VC的最大·清除率和IC50分別為（52.87±2.08）%和1.193 mg/mL、（66.83±1.56）%和0.676 mg/mL、（71.43±0.25）%和0.269 mg/mL、（76.68±0.62）%和0.003 mg/mL。由此可見(jiàn)，清除DPPH自由基和·能力順序?yàn)閂C＞UM-30＞UM-15＞BFPs。

圖4 BFPs、UM-15和UM-30對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

圖5 BFPs、UM-15和UM-30對(duì)·的清除能力Fig. 5 Superoxide anion radical scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

2.3.2 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力

由圖6可知，在質(zhì)量濃度為0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，多糖BFPs、UM-15及UM-30對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用均高于VC。隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，3 種多糖對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用均逐漸增強(qiáng)，且存在顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制效果達(dá)到最佳水平。此時(shí)，多糖BFPs、UM-15和UM-30的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為（44.44±0.22）%、（55.35±0.16）%、（65.83±0.67）%，分別是VC最大抑制率的1.60、1.99、2.36 倍。BFPs、UM-15、UM-30和VC的IC50分別為1.971、1.035、0.771 mg/mL和3.394 mg/mL。

圖6 BFPs、UM-15和UM-30對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力Fig. 6 Lipid peroxidation-inhibitory capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

圖7 BFPs、UM-15和UM-30對(duì)的清除能力Fig. 7 Nitrite ion scavenging capacity of BFPs, UM-15 and UM-30

由圖7可以看出，在0.2～4.0 mg/mL范圍內(nèi)，BFPs、UM-15及UM-30對(duì)的清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，且不同多糖對(duì)的清除能力存在顯著差異（P＜0.05）。質(zhì)量濃度達(dá)4.0 mg/mL時(shí)，BFPs（（73.08±1.25）%，IC50=1.384 mg/mL）、UM-15（（78.65±0.58）%，IC50=0.990 mg/mL）及UM-30（（84.46±1.43）%，IC50=0.697 mg/mL）的清除率達(dá)到最大，但仍低于VC的最大清除率（（97.12±2.34）%，IC50=0.017 mg/mL）。

綜上所述，超聲波處理能夠?qū)е潞诩觼龉麑?shí)多糖抗氧化活性顯著提高。通常，活性物質(zhì)的抗氧化作用歸因于其供氫能力。Wang Junlong等研究發(fā)現(xiàn)，多糖中糖醛酸基團(tuán)的存在可以觸發(fā)異頭碳的氫原子，發(fā)生抗氧化反應(yīng)[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲波處理能夠使黑加侖多糖中糖醛酸含量增加，提高多糖供給氫原子的能力，進(jìn)而增加多糖的抗氧化活性，這與You Qinghong等研究結(jié)果一致[29]。另一方面，超聲波處理能夠使多糖分子質(zhì)量降低，使位于多糖內(nèi)核中的活性基團(tuán)暴露，提供更多的活性位點(diǎn)與自由基反應(yīng)，進(jìn)而抑制氧化反應(yīng)[23]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)原多糖與降解多糖對(duì)DPPH自由基、O2－·的清除能力及抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力存在差異，這可能是由于多糖發(fā)揮不同抗氧化活性時(shí)作用機(jī)制是不同的。Sun Liqin[30]、Shi Meijia[31]等在研究原多糖與降解多糖抗氧化活性時(shí)得到與本實(shí)驗(yàn)一樣的結(jié)論。關(guān)于天然多糖抗氧化活性作用機(jī)制及多糖在不同實(shí)驗(yàn)方法中抗氧化活性存在差異的原因有待進(jìn)一步深入探討。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波降解黑加侖果實(shí)多糖，制備了兩種不同分子質(zhì)量多糖。研究結(jié)果表明，超聲時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)多糖的理化性質(zhì)（黏均分子質(zhì)量、振動(dòng)黏度、溶解度、還原糖含量和糖醛酸含量）的影響越顯著；與原多糖相比，超聲波處理并沒(méi)有改變多糖的基本結(jié)構(gòu)；此外，降解多糖對(duì)DPPH自由基、O2－·和NO2－的清除能力及對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用均強(qiáng)于原多糖，且降解時(shí)間越長(zhǎng)效果越好。因此，超聲波是一種在不破壞多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)的條件下，有效地改善多糖的理化性質(zhì)，并提高其生物活性的手段，而超聲波處理的黑加侖果實(shí)多糖可能成為保障人類(lèi)健康的天然抗氧化劑潛在來(lái)源。