何 澤,張 敏,寧 卓*,向小平,劉俊建,侯欽宣,趙 謙

區(qū)域地下水環(huán)境演化的分子生物學(xué)特征——以太行山前平原淺層水為例

何 澤1,2,張 敏1,寧 卓1,2*,向小平1,2,劉俊建1,2,侯欽宣1,2,趙 謙1,2

(1.中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所,河北 石家莊 050061；2.中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局/河北省地下水污染機(jī)理與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050803)

以太行山前平原大沙河流域的典型區(qū)域淺層地下水為研究對(duì)象,沿岸布點(diǎn)采集樣本94組,采用基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù),以硝酸鹽、溶解氧、化學(xué)需氧量為環(huán)境因子,分析指示環(huán)境因子演化的微生物群落結(jié)構(gòu)特征及功能性指示菌屬.結(jié)果顯示:采用累積概率分布法將樣品分為背景(B)、硝酸鹽污染(N)、有機(jī)污染(O)、有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染(O_N)4組,該分類與地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的I類、II類水分類相近;污染使種群結(jié)構(gòu)趨于一致,且有機(jī)污染可使微生物群落豐富度降低;不同污染類型導(dǎo)致環(huán)境演化的功能性指示菌屬分別為:和 unclassified_f_Micromonosporaceae指示有機(jī)污染,和指示硝酸鹽污染,和指示硝酸鹽和有機(jī)復(fù)合污染.以上構(gòu)建的分子生物學(xué)方法可為區(qū)域環(huán)境調(diào)查及微生物修復(fù)提供理論依據(jù).

大沙河；地下水；硝酸鹽污染；有機(jī)污染；微生物

我國(guó)京津冀[1]、長(zhǎng)三角[2]、珠三角[3]、淮河流域[4]等地下水污染調(diào)查發(fā)現(xiàn),“三氮”及有機(jī)污染普遍存在,且污染源點(diǎn)多面廣,呈現(xiàn)由點(diǎn)到面,由淺入深,由城市向周邊擴(kuò)散的趨勢(shì),區(qū)域地下水環(huán)境質(zhì)量總體惡化[5].

雖然我國(guó)部分重點(diǎn)區(qū)域已開(kāi)展了較為系統(tǒng)的地下水污染調(diào)查,但當(dāng)前國(guó)內(nèi)外污染調(diào)查均主要檢測(cè)地下水中無(wú)機(jī)?有機(jī)及毒理微生物(總大腸菌群和細(xì)菌總數(shù))等水質(zhì)指標(biāo)[6-7],并以此評(píng)價(jià)地下水的環(huán)境演化趨勢(shì).采用該系列指標(biāo)的污染調(diào)查,無(wú)論采用何種評(píng)價(jià)方法,表征的均是地下水受污染程度,監(jiān)測(cè)反映的也僅是部分污染物變化規(guī)律,污染導(dǎo)致區(qū)域尺度地下水環(huán)境演化機(jī)理揭示不足.

實(shí)際上,該演化可認(rèn)為主要是地下水環(huán)境中微生物利用污染物的微生物水文地球化學(xué)過(guò)程,該過(guò)程在污染場(chǎng)地尺度研究已較為成熟[8-11].針對(duì)我國(guó)普遍發(fā)現(xiàn)的“三氮”和有機(jī)污染物,微生物類似于催化劑主要通過(guò)參與氧化還原反應(yīng)的方式控制污染物的降解轉(zhuǎn)化,而同時(shí)微生物的群落結(jié)構(gòu)“指紋”會(huì)隨之發(fā)生演變,因而,通過(guò)“指紋”的演變可追溯微生物水文地球化學(xué)過(guò)程,從機(jī)理上揭示地下水環(huán)境演化[12-13].由于當(dāng)前微生物檢測(cè)主要采用高通量測(cè)序?宏基因測(cè)試等分子生物學(xué)技術(shù),因此該技術(shù)方法被稱為“分子生物學(xué)技術(shù)”(MBTs)[14-15].

分子生物學(xué)技術(shù)近10a來(lái)在國(guó)外污染場(chǎng)地研究中被廣泛應(yīng)用,美國(guó)環(huán)保署(USEPA)統(tǒng)計(jì)的2009~ 2012年百余個(gè)研究中均使用了該技術(shù)[16],但區(qū)域尺度研究罕見(jiàn);我國(guó)在地下水污染領(lǐng)域?qū)υ摷夹g(shù)的應(yīng)用較少,僅限于利用高通量測(cè)序技術(shù)評(píng)估場(chǎng)地地下水污染空間演化趨勢(shì)[17],或應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究地下水石油污染條件下,微生物群落結(jié)構(gòu)?活性與水化學(xué)指標(biāo)間的響應(yīng)關(guān)系[18].而區(qū)域尺度研究?jī)H限2km左右小流域微生物空間差異分析,且未與污染指標(biāo)建立聯(lián)系[19],國(guó)內(nèi)大尺度區(qū)域與污染相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

本研究以太行山前平原典型淺層地下水為例,在大沙河沖洪積扇中上部沿河布設(shè)淺層地下水采樣點(diǎn),將微生物高通量測(cè)序與污染水質(zhì)指標(biāo)測(cè)試分析相結(jié)合,在累積概率分布法評(píng)價(jià)污染程度基礎(chǔ)上,分背景、硝酸鹽污染、有機(jī)污染及有機(jī)&硝酸鹽復(fù)合污染4組別,分析不同組別微生物的群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系,通過(guò)尋找表征典型微生物地球化學(xué)過(guò)程的功能性指示微生物,建立揭示區(qū)域尺度淺層地下水環(huán)境演化的分子生物學(xué)技術(shù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于太行山前的大沙河沖洪積扇孔隙地下水系統(tǒng)中上部,面積約6000km2.大沙河屬于海河流域大清河系,起源于山西,自西向東流經(jīng)河北省中南部的曲陽(yáng)?行唐?新樂(lè)、定州、無(wú)極、深澤、安國(guó)等縣市,并入潴龍河后,匯入白洋淀,研究區(qū)內(nèi)河段長(zhǎng)度約150km.大沙河流域自西向東,地下含水層厚度逐漸增大,巖性逐漸變細(xì),水量逐漸變小,礦化度不斷增大.研究對(duì)象淺層地下水,多為全新統(tǒng)(Q4)和上更新統(tǒng)(Q3)地層,巖性以粗砂、中砂為主,下部有卵礫石.沖洪積扇間及邊緣地帶為中細(xì)砂,賦水性相對(duì)較差;軸部、古河道和現(xiàn)代河床兩側(cè)為粗砂,賦水性強(qiáng).水化學(xué)類型以重碳酸鈣和重碳酸鈣鎂型為主,礦化度小于1g/L.地下水以自然降水的垂直入滲和地下水的側(cè)向徑流補(bǔ)給,并接受田間灌溉和河道入滲補(bǔ)給.區(qū)內(nèi)地下水的排泄以人工開(kāi)采為主,已形成降落漏斗[20-21].大沙河沿岸農(nóng)畜業(yè)和小型工業(yè)較為發(fā)達(dá),已造成大沙河及周邊地下水污染[22-23].

1.2 樣品采集與運(yùn)輸保存

圖1 采樣布點(diǎn)

2017年10月,沿研究區(qū)地下水流向在大沙河兩岸布設(shè)采集地下水樣品94個(gè).布點(diǎn)原則為:(1)覆蓋大沙河沖洪積扇中上部大部分面積,使數(shù)據(jù)反映該區(qū)整體微生物多樣性特征;(2)在易產(chǎn)生硝酸鹽污染的養(yǎng)殖場(chǎng)?連片農(nóng)田及易發(fā)生有機(jī)污染的工廠周邊加密布點(diǎn),重點(diǎn)研究硝酸鹽污染?有機(jī)污染對(duì)地下水微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.具體布點(diǎn)見(jiàn)圖1.采樣前按照區(qū)域地下水污染調(diào)查評(píng)價(jià)規(guī)范[6]進(jìn)行洗井、現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試.測(cè)試數(shù)據(jù)穩(wěn)定后采集樣品.采樣選擇5L超純水塑料桶,采集時(shí)棄去超純水,并用待采地下水清洗3遍后將水桶灌滿,密封.采集的樣品置于4℃保溫箱中,在1~2d內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行抽濾等預(yù)處理.抽濾采用高溫滅菌的孔徑0.22μm,直徑50mm的聚四氟乙烯(TPFE)微孔濾膜,每張濾膜過(guò)濾2L樣品,置于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中保存,統(tǒng)一存放于-86℃冰箱中,以備提取DNA等后續(xù)工作.

1.3 樣品測(cè)試

水質(zhì)指標(biāo)測(cè)試:常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)包括溶解氧(DO)?硝酸鹽(NO3-)、化學(xué)需氧量(COD);有機(jī)、無(wú)機(jī)濃度均根據(jù)中國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法GBT 5750.6.2.1-2006,委托自然資源部地下水礦泉水及環(huán)境監(jiān)測(cè)中心測(cè)試.

高通量測(cè)序:利用MP的FastDNATMSpin Kit for Soil試劑盒進(jìn)行樣品DNA提取,取一張濾膜在冰上融化,用無(wú)菌剪刀剪碎,置于試劑盒提供的珠磨離心管中,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取.利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),使用Nano Drop 2000進(jìn)行DNA濃度測(cè)定.PCR擴(kuò)增及后續(xù)測(cè)序采用國(guó)際地球微生物計(jì)劃中推薦使用的16S rDNA擴(kuò)增引物序列(http://www.earthmicrobiome.org/emp- standard-protocols/16s/),目標(biāo)片段可兼顧細(xì)菌和古菌.上游引物為515FB(GTGYCAGCMGCCGCGG- TAA),下游引物為806RB(GGACTACNVGGGTW- TCTAAT).試劑為T(mén)ransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,擴(kuò)增儀為ABI GeneAmp? 9700型,擴(kuò)增體系為20μL.將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行回收,利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)結(jié)果分析方法

樣品污染類型分組;根據(jù)水化學(xué)測(cè)定的DO、NO3-、COD濃度,將采集的樣品分為有機(jī)污染組(O)、硝酸鹽污染組(N)、有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染組(O_N)及未污染背景組(B).分組閾值的篩選主要基于各指標(biāo)累積概率曲線的拐點(diǎn),當(dāng)有多個(gè)拐點(diǎn)時(shí),結(jié)合地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇.

環(huán)境因子篩選:使用SPSS12軟件,采用皮爾遜相關(guān)性分析篩選環(huán)境因子.

結(jié)果可靠性檢驗(yàn):將Miseq高通量測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,并按照最小樣品序列數(shù)進(jìn)行抽平處理.抽平后,采用稀釋曲線分析對(duì)測(cè)序結(jié)果可靠性進(jìn)行檢驗(yàn);采用偏最小二乘法判別分析,對(duì)分組方案的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn).

微生物群落結(jié)構(gòu)分析:在OTU水平上進(jìn)行了Alpha多樣性分析.Alpha多樣性分析主要有反映測(cè)序覆蓋度的coverage指數(shù),反映群落豐富度的chao、ACE和sobs指數(shù),以及反映群落多樣性的shannon和simpson指數(shù).采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)比對(duì),物種分類數(shù)據(jù)庫(kù)為silva128/16S,分類置信度設(shè)為0.7.基于該分類,在屬(genus)水平,對(duì)各組樣品進(jìn)行了韋恩圖分析.

地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物分析:首先進(jìn)行了代表性菌種分析,該分析包括群落組成分析及組間差異顯著性檢驗(yàn).群落組成分析以各組樣品物種豐度的中位數(shù)進(jìn)行計(jì)算;組間差異顯著性檢驗(yàn)是在屬水平上利用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析,其中,顯著性值多重檢驗(yàn)校正方法采用fdr,CI計(jì)算方法采用scheffe.其次,為分析代表性菌種與污染環(huán)境因子間的關(guān)聯(lián),確定功能性指示微生物,對(duì)分組樣品進(jìn)行了相關(guān)性熱圖分析,相關(guān)系數(shù)類型為Spearman.最后,比對(duì)已有研究,對(duì)功能性指示微生物對(duì)環(huán)境演化的指示作用進(jìn)行了分析印證.以上分析在I-sanger云平臺(tái)(http://www.i-sanger.com/)完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品污染類型分組

繪制94個(gè)樣品DO、NO3-和COD濃度的累積概率曲線如圖2所示.

從圖中看出,lg(COD)的拐點(diǎn)為0mg/L,即COD的拐點(diǎn)為1mg/L,此拐點(diǎn)恰為地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的I類和II類分界值,可選為有機(jī)污染判定閾值;NO3-存在兩個(gè)拐點(diǎn),分別為10和88.4mg/L,此拐點(diǎn)恰為地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)I類與II類?III類與IV類的分界值,考慮到III類以上水不再適合飲用,選取III類標(biāo)準(zhǔn)88.57mg/L為NO3-污染判定閾值;DO的兩個(gè)拐點(diǎn)為3.0mg/L及6.0mg/L左右,一般認(rèn)為, DO小于3.0mg/L時(shí)可能存在有機(jī)污染.故有機(jī)污染用COD和DO雙指標(biāo)進(jìn)行判斷,當(dāng)COD>1而DO<3時(shí),表示存在有機(jī)污染,且正在降解;當(dāng)COD>1而DO>3時(shí),表示存在有機(jī)污染,且未降解;當(dāng)COD<1而DO<3時(shí),表示曾經(jīng)發(fā)生有機(jī)污染,但已降解;當(dāng)COD<1而DO>3時(shí),表示無(wú)有機(jī)污染.當(dāng)硝酸鹽污染與有機(jī)污染判斷標(biāo)準(zhǔn)均符合時(shí),定為有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染,具體分組規(guī)則見(jiàn)下表(表1):

圖2 累積概率曲線分析

表1 樣品污染類型分組規(guī)則(mg/L)

2.2 測(cè)序結(jié)果及分組方案可靠性檢驗(yàn)

2.2.1 測(cè)序結(jié)果可靠性檢驗(yàn) 通過(guò)對(duì)采集水樣中細(xì)菌、古菌進(jìn)行測(cè)序,94個(gè)樣品共獲得有效序列3147296條,平均每個(gè)樣品序列33482條,每條序列長(zhǎng)度平均為292bp.為了使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,按照各樣品中序列最低數(shù)量23926條,對(duì)樣品序列進(jìn)行抽平處理.

對(duì)樣品進(jìn)行稀釋曲線分析,評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類群.94個(gè)樣品的sobs及shannon稀釋曲線見(jiàn)圖3.由圖可見(jiàn),各樣品的稀釋曲線已趨于平緩,即使再增大測(cè)序數(shù)據(jù)量對(duì)OTU的發(fā)現(xiàn)也無(wú)貢獻(xiàn),說(shuō)明樣品的OTU覆蓋度已基本飽和,測(cè)序數(shù)據(jù)量及抽平結(jié)果合理,可信度高.

圖3 相似度為97%條件下各樣本的稀釋曲線

2.2.2 分組方案可靠性檢驗(yàn) 為了檢驗(yàn)分組方案是否可靠,采用偏最小二乘法(PLS-DA)判別分析,在OTU水平上進(jìn)行檢驗(yàn).

主要方法是利用數(shù)學(xué)模型將各組加以區(qū)分,分析組間是否存在系統(tǒng)差異,從而判斷分組是否有意義.經(jīng)過(guò)PLS-DA分析,得到的結(jié)果如圖4.O組、N組及B組分別位于不同象限,O_N組則大部分位于上部象限,分布基本位于N組、O組復(fù)合范圍,證明此分組方案很好的區(qū)分了有機(jī)污染、硝酸鹽污染、有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染及背景,具有很高的可靠性.

圖4 分組方案PLS-DA分析

2.3 樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了明確該區(qū)域有機(jī)污染、硝酸鹽污染是否會(huì)使其中的地下水微生物多樣性較背景產(chǎn)生較大差異,本研究進(jìn)行了Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析及物種韋恩圖分析.

如表2所示,Coverage指數(shù)反應(yīng)測(cè)序結(jié)果對(duì)群落的覆蓋度,4個(gè)分組的Coverage指數(shù)均值均為0.97,展示本次測(cè)序?qū)θ郝涞母采w度好,數(shù)據(jù)可靠性高.

Chao、ACE和sobs指數(shù)用于分析群落物種豐富度,它的數(shù)值越大,表示樣品所包含的物種種類越豐富.總體上,4個(gè)分組的Chao?ACE和sobs指數(shù)均為N組最大,O組最小,說(shuō)明硝酸鹽可提高微生物豐富度,而有機(jī)污染減少物種豐富度.

Shannon和Simpson指數(shù)是反映樣品物種多樣性的2個(gè)指數(shù),它們不僅反映物種豐富度,還指示了物種的均勻度.它們的數(shù)值越大,表示該樣品中的物種種類越多且分布越均勻,Shannon指數(shù)對(duì)物種豐富度更敏感,而Simpson指數(shù)對(duì)物種均勻度更為敏感[24].一般認(rèn)為, Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化規(guī)律相反.將4組樣品相比較,Shannon指數(shù)N組和B組最大,而O組最小;Simpson指數(shù)O組最大,而其他組相當(dāng).

綜合Alpha多樣性各指標(biāo)發(fā)現(xiàn),有機(jī)污染可降低微生物群落物種的豐富度.該結(jié)論與作者于2018年在附近區(qū)域采集的污染地下水樣品的多樣性結(jié)果一致,即在有機(jī)污染下,微生物種群豐富度降低.且本研究各分組的Alpha多樣性均高于2018年樣品[25].

表2 樣品Alpha多樣性指數(shù)(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)

Beta多樣性(Beta diversity)分析結(jié)果較Alpha多樣性分析更為直觀,本研究使用Bray-curtis距離算法進(jìn)行Beta多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA).分析結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖5 Beta 多樣性的主坐標(biāo)分析(PCoA)

由圖5可見(jiàn),第一軸?第二軸的解釋度分別為10.09%及5.71%.有機(jī)污染組(O)樣品主要聚集在第一象限,與未污染背景組(B)、硝酸鹽污染組(N)、復(fù)合污染組(O_N)的樣品聚集位置有較大差異,說(shuō)明有機(jī)污染會(huì)導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大改變; O_N組和N組與B組位置有較大重疊,表明硝酸鹽污染導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)的變異較小;O組與N組位置差異明顯,O_N組介于兩者之間,表明污染物不同會(huì)導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)的差異;B組樣品在圖中較為分散,污染組樣品位置則相對(duì)集中,且B組與其它組均有不同程度的重合,說(shuō)明在污染物作用下,地下水微生物的種群結(jié)構(gòu)會(huì)趨于一致.以上結(jié)論基本與2018年區(qū)域微生物調(diào)查結(jié)果一致,區(qū)別在于2018年的硝酸鹽污染導(dǎo)致的種群差異大于有機(jī)污染[25].

將樣品所含13013個(gè)OTU進(jìn)行分類學(xué)比對(duì)得知,所有樣品的物種共屬于67個(gè)門(mén)、185個(gè)綱、367個(gè)目、689個(gè)科、1487個(gè)屬及3301個(gè)種,物種組成較為豐富.在OTU水平上,使用韋恩圖分析對(duì)B、O、N、O_N 4組所含共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),初步比較各組物種組成的差異,具體的分析結(jié)果見(jiàn)圖6.

圖6 不同樣品之間比較的韋恩圖

由圖6可知, B、O、N、O_N組分別包含8958、7563、6928、5217種OTU,各自獨(dú)有852、519、253、119種OTU,4組共有的OTU為3618種. O_N組與O組、N組共享的OTU數(shù)量很接近,且獨(dú)有的OTU最少.由以上結(jié)果可知,背景組共享及獨(dú)有的微生物組成最為豐富,有機(jī)污染則產(chǎn)生了更多與背景組不同的獨(dú)有物種,而硝酸鹽污染及有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染產(chǎn)生的獨(dú)有物種則較少.

2.4 地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物

樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)較為豐富,要利用該信息進(jìn)行地下水環(huán)境演化的功能性指示,則需進(jìn)一步分析篩選.首先明確各組中具有代表性的菌種類型,其次根據(jù)代表性菌種與污染環(huán)境因子間的關(guān)系,判斷其對(duì)地下水環(huán)境演化是否有指示作用,最后比對(duì)已有研究,印證其指示作用,最終確定地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物.

代表性菌種分析包括群落組成分析及組間差異顯著性檢驗(yàn).群落組成分析結(jié)果見(jiàn)圖7.

圖7 細(xì)菌組成屬分類水平的比較

豐度>0.02%

由圖7可見(jiàn),所有樣品最高豐度物種均為unclassified_f_Comamonadaceae(未分類叢毛單胞菌科),各組豐度從大到小依次為O組、B組、O_N組和N組;、、和在O_N組和N組具有較高的豐度;、在B組和N組具有較高豐度;而在O組豐度較高.據(jù)此判斷,有機(jī)污染能夠促進(jìn)unclassified_f_Comamonadaceae_的生長(zhǎng),能夠抑制?;而硝酸鹽污染能促進(jìn)、、和的生長(zhǎng).同樣,在2018年區(qū)域調(diào)查的微生物樣品中也發(fā)現(xiàn)unclassified_ f_Comamonadaceae為分布最廣的微生物,、、在2018年樣品中也為優(yōu)勢(shì)菌種[25].這些菌種雖然豐度較高,但是否在組間具有代表性,可將各組間很好的區(qū)分,還需進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn).組間差異顯著性檢驗(yàn)可評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平,獲得組間代表性菌種.入選的菌種首先具有顯著性差異,其次豐度在各組較高.本研究采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H test),進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn),確定代表性菌種,具體結(jié)果見(jiàn)圖8.

圖8左側(cè)為屬水平下的物種名,物種對(duì)應(yīng)的柱狀圖長(zhǎng)度表示該物種在各分組中的平均相對(duì)豐度,右側(cè)為顯著性值(* 0.01<￡0.05,** 0.001<￡0.01, ***￡0.001),圖中展示了具有顯著性差異的豐度位列前15的物種.可見(jiàn),N組和菌屬, O組unclassified_ f_Micromonosporaceae和, O_N組和均具有顯著性差異.這些菌種在各組中雖然豐度不是最高,但可以更好區(qū)分各組,故將這些菌種確定為各組的代表性菌種.

圖8 組間差異顯著性檢驗(yàn)(具有顯著性差異的豐度前15物種)

代表性菌種與地下水污染環(huán)境因子的關(guān)系利用相關(guān)性熱圖(Heatmap)進(jìn)行揭示,結(jié)果如圖9.

由圖可見(jiàn):N組的代表性菌種和與環(huán)境因子NO3-具有很好的相關(guān)性,同時(shí),菌種與環(huán)境因子DO正相關(guān),說(shuō)明其應(yīng)為一類好氧菌,與DO負(fù)相關(guān),其應(yīng)為一類厭氧菌O組代表性菌種unclassified_ f_Micromonosporaceae和與環(huán)境因子COD顯著正相關(guān),說(shuō)明該代表性菌種可存在于COD環(huán)境中,且2菌種與環(huán)境因子DO、NO3-顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明這兩種菌可能為厭氧菌種,且與硝酸鹽污染無(wú)關(guān)O_N組代表性菌種和與COD、NO3-、DO正相關(guān),證明其存在于有機(jī)硝酸鹽復(fù)合污染區(qū)域,且可能為好氧菌種.

O組unclassified_f_Micromonosporaceae和在本組中具有顯著性差異且豐度較高,其典型特點(diǎn)為利用有機(jī)物進(jìn)行厭氧降解作用,且降解能力較強(qiáng)[26-27],由此判斷,此兩菌屬可作為本區(qū)域地下水有機(jī)污染指示菌屬.

圖9 相關(guān)性熱圖分析(圖中數(shù)字為相關(guān)性R值)

N組和菌屬同樣在該組具有顯著性差異且豐度相對(duì)較高,其中屬有菌種為專性好氧菌,有反硝化功能[28],菌屬一般為兼性厭氧菌,其可同化硝酸鹽,也可進(jìn)行硝酸鹽呼吸(反硝化)作用[29],因此,這2種菌屬可作為本區(qū)域地下水硝酸鹽污染指示菌屬.

O_N組和具有顯著性差異且豐度占據(jù)優(yōu)勢(shì),這2種菌屬均為典型的好氧反硝化菌屬[30],此類菌屬是在好氧或兼性好氧條件下以有機(jī)碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌,多發(fā)現(xiàn)于污水處理及養(yǎng)殖糞便處理系統(tǒng)中,可作為高氮高有機(jī)質(zhì)復(fù)合污染的指示微生物.但菌屬下屬菌種多、分布廣、功能多,當(dāng)其作為指示菌種時(shí)應(yīng)結(jié)合其屬下具體菌種進(jìn)行判斷指示環(huán)境.

3 結(jié)論

3.1 根據(jù)電子受體濃度,采用累積概率分布法可將樣品進(jìn)行較好分類,該分類結(jié)果閾值與地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的I類、II類水分類閾值基本一致;

3.2 對(duì)于研究區(qū)地下水環(huán)境,有機(jī)污染造成了微生物群落豐富度降低;

3.3 該區(qū)域具有顯著差異的、且在某污染組具有顯著性差異的菌屬可作為不同污染類型環(huán)境演化的功能性指示菌屬,分別為:和 unclassified_f_Micromonosporaceae指示有機(jī)污染,和指示硝酸鹽污染,和指示硝酸鹽和有機(jī)復(fù)合污染.

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致謝：本研究的現(xiàn)場(chǎng)采樣工作由中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所孫繼朝研究員指導(dǎo),劉丹丹副研究員,張千千副研究員等協(xié)助完成,在此表示感謝.

The environmental evolution research of regional groundwater using molecular biotechnologies: a case from the shallow groundwater in front of the Taihang Mountains.

HE Ze1,2, ZHANG Min1, NING Zhuo1,2*, XIANG Xiao-ping1,2, LIU Jun-Jian1,2, HOU Qin-xuan1,2, ZHAO Qian1,2

(1.Institute of Hydrogeology and Environmental Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Shijiazhuang 050061, China；2.Key Labratory of Groundwater Remediation, China Geological Survey/Hebei, Shijiazhuang 050803, China)., 2019,39(8)：3484~3492

The shallow groundwater in Dasha Rivers Basin was selected as the study subject, because of it is recognized as one of the typical regions in front of the Taihang Mountains. 94samples were collected along the river. The 16s rDNA gene sequences were tested by high-throughput sequencing technologies. According to the environmental factors of NO3-, COD and DO, the microbial communities and the functional indicator microorganisms related to environmental evolution were studied. The results showed that, using the cumulative probability distribution method, the samples were divided into four groups: background, nitrate pollution, organic pollution and organic-nitrate pollution (B group, N group, O group, O_N group). This grouping rules were close to the I and II water grade in the quality standard of groundwater. The pollution driven the microbial communities to converge, and the organic pollution could decrease the richness diversity of microbial communities. The functional indicator microorganisms related to environmental evolution in the different pollution region were summarized as followed: organic pollutioncould be indicated byand unclassified_f_Micromonosporaceae, nitrate pollution could be indicated byand, organic-nitrate pollution could be indicated byand. The molecular biotechnologies and analysis methods used in this research could provide the theoretical evidence for region environmental investigations and bioremediation.

Dasha River；groundwater；nitrate pollution；organic pollution；microorganisms

X172

A

1000-6923(2019)08-3484-09

何 澤(1981-),男,天津人,高級(jí)工程師,博士,主要從事地質(zhì)微生物研究.發(fā)表論文30余篇.

2019-01-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFC1803002);中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局地質(zhì)調(diào)查項(xiàng)目(DD20160309、DD20190331);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41602261);中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(SK201702)

* 責(zé)任作者, 副研究員, ningzhuozhuo@163.com