馮光志，劉曉敏，黎玉婷，沈彩奕，王溢華，石玉

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205）

平菇（Pleurotus ostreatus）又稱糙皮側(cè)耳，隸屬擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬食用菌，是世界上栽培廣泛的食用菌之一[1]。平菇肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，而且還具有較高的醫(yī)療保健價(jià)值，是名副其實(shí)的健康食品[2-6]。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)健康飲食越發(fā)重視，對(duì)平菇的需求也日益旺盛。鋅是人體必需微量元素，缺鋅可導(dǎo)致各種生理生化異常，如生長(zhǎng)遲緩、免疫功能受損、認(rèn)知障礙、過(guò)早死亡等[7]。食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且具有一定毒性，通過(guò)利用平菇的富集作用，將鋅鹽中無(wú)機(jī)形態(tài)的鋅，與平菇體內(nèi)的多糖、蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、小肽等生物分子結(jié)合，形成易于人體吸收且毒性小的有機(jī)鋅，更有利于鋅的免疫功能和平菇保健功能的發(fā)揮，提高平菇品質(zhì)[8]。

已有研究表明不同種類金屬離子及其不同濃度梯度對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)育、生物轉(zhuǎn)化率及子實(shí)體重金屬含量均有影響[7-13]。平菇在栽培生長(zhǎng)的過(guò)程中會(huì)合成多種木質(zhì)纖維素降解酶，以分解秸稈和麩皮中的纖維素和木質(zhì)素，通過(guò)測(cè)定平菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中的酶活，可以考察平菇對(duì)培養(yǎng)基料中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的利用情況。該試驗(yàn)通過(guò)袋料栽培研究不同濃度Zn2+對(duì)平菇生長(zhǎng)和胞外酶活性的影響，確定平菇袋料栽培最適Zn2+濃度，以期為進(jìn)一步開發(fā)富鋅食用菌產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌種平菇保藏于武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、葡萄糖、木糖、濾紙、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無(wú)水亞硫酸鈉、硝酸、高氯酸、雙氧水（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木聚糖：sigma公司。

AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-S6恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SW-CJ-ZG超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備科技有限公司；722型紫外可見分光光度計(jì)：天津市普瑞斯儀器有限公司；iCE 3500型原子吸收光譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）固體培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基：玉米芯58%，秸稈20%，麥麩20%，石灰1%，石膏1%，與水以1∶1.2質(zhì)量比均勻混合，分裝于培養(yǎng)袋中，每袋裝樣量180 g。

1.3 方法

1.3.1 富鋅平菇的接種栽培

在基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基中添加硫酸鋅，使Zn2+終濃度為 0、300、600、900 mg/kg，分別裝袋，在無(wú)菌條件下，將活化好的斜面平菇菌絲以1 cm2菌塊大小分別接種于培養(yǎng)袋中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 粗酶液的制備

在平菇生長(zhǎng)的7個(gè)時(shí)期（1：菌絲半袋；2：菌絲滿袋；3：滿袋后熟；4：菌芽期；5：伸長(zhǎng)期；6：成熟期；7：采后），分別在無(wú)菌條件下，從培養(yǎng)袋中稱取菌絲1 g混合，置于研缽中加入10 mL的去離子水研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，再量取5 mL去離子水洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃，8 000 r/min下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.3 平菇菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中羧甲基纖維素鈉酶（carboxymethyl cellulose enzyme，CMCase）活性的測(cè)定

向試管中加入800 μL 1%羧甲基纖維素鈉溶液、200μL粗酶液，混勻后在35℃的水浴鍋中水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴煮沸5 min后取出冷卻，加入7.5 mL蒸餾水稀釋后，在540 nm下測(cè)定含糖量，以沸水滅活的粗酶液作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)。酶活力通過(guò)反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.4 平菇菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中木聚糖酶活性的測(cè)定

向試管中加入800 μL 1%木聚糖溶液、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力以反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，酶活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化木糖的毫克數(shù)。

1.3.5 平菇菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中淀粉酶活性的測(cè)定

向試管中加入800 μL 1%可溶性淀粉溶液、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力通過(guò)反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.6 平菇菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中濾紙酶活性的測(cè)定

向試管中加入800 μL緩沖液、3片直徑1 cm的小濾紙片、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力通過(guò)反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.7 Zn2+含量的測(cè)定

將采收后的食用菌子實(shí)體菌蓋和菌柄分開，在60℃烘箱中烘干至恒定質(zhì)量，采用原子吸收光譜法測(cè)定Zn2+含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn2+對(duì)平菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響

不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)有較大影響。隨著Zn2+質(zhì)量濃度的增加，菌絲生長(zhǎng)速度加快，說(shuō)明添加適量Zn2+會(huì)促進(jìn)平菇菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為600 mg/kg時(shí)，平菇菌絲生長(zhǎng)最快，隨著Zn2+質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增大，菌絲生長(zhǎng)速度又逐漸下降，甚至生長(zhǎng)被抑制。從菌絲的形態(tài)、生長(zhǎng)勢(shì)和滿袋時(shí)間看，添加600 mg/kg Zn2+處理的平菇菌絲潔白、濃密、粗壯且平菇菌絲提前長(zhǎng)滿菌袋。

2.2 Zn2+對(duì)羧甲基纖維素酶分泌的影響

不同Zn2+添加量羧甲基纖維素酶活性變化趨勢(shì)見圖1。

圖1 不同Zn2+添加量羧甲基纖維素酶活性變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of carboxymethyl cellulose enzyme activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖1可以看出，在菌絲生長(zhǎng)的前4個(gè)時(shí)期，不同Zn2+添加量的平菇胞外羧甲基纖維素酶活性均保持較低的活性，之后開始緩慢升高，在子實(shí)體成熟期，不同Zn2+添加量的胞外羧甲基纖維素酶活性均處于峰值，活性大小依次為：600 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，分別為 19.87、17.15、11.75、11.42 U/g，子實(shí)體采摘后纖維素酶活性呈下降趨勢(shì)。

2.3 Zn2+對(duì)木聚糖酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性變化趨勢(shì)見圖2。

圖2 不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性變化趨勢(shì)Fig.2 Changes of xylanase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖2可以看出，在平菇菌絲長(zhǎng)至半袋時(shí)，600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料胞外木聚糖酶活性最高，之后不同Zn2+添加量培養(yǎng)料的木聚糖酶活性均有緩慢下降，并保持穩(wěn)定，后熟期后逐漸升高，在子實(shí)體成熟期，木聚糖酶的活性均達(dá)到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料，為20.49 U/g，其余由大到小依次 0 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分別為14.34、13.48、11.22 U/g。從整個(gè)周期來(lái)看，平菇木聚糖酶在菌絲生長(zhǎng)階段活性較小，轉(zhuǎn)入生殖階段后小幅增加，子實(shí)體成熟前大幅提高，成熟期達(dá)到最大，子實(shí)體采摘后降低。

2.4 Zn2+對(duì)濾紙酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇濾紙酶活性變化趨勢(shì)見圖3。

圖3 不同Zn2+添加量平菇濾紙酶活性變化趨勢(shì)Fig.3 Changes of filter paper cellulase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖3可知，在菌絲生長(zhǎng)的前4個(gè)時(shí)期，不同Zn2+添加量的平菇胞外濾紙酶活性均保持較低的活性，菌芽期后開始逐漸升高，在子實(shí)體成熟期，不同Zn2+添加量的胞外濾紙酶活性均達(dá)到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+，為8.39 U/g，其余由大到小依次為300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分別為6.70、4.76、4.50U/g。從整個(gè)周期來(lái)看，平菇胞外濾紙酶在菌絲生長(zhǎng)階段活性較小，后熟階段前期小幅度下降后維持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入生殖階段小幅增加，子實(shí)體成熟前大幅提高，成熟期達(dá)到最大，子實(shí)體采摘后降低。

2.5 Zn2+對(duì)淀粉酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性變化趨勢(shì)Fig.4 Changes of amylase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

由圖4可知，在平菇菌絲長(zhǎng)至滿袋時(shí)，不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶均有小幅升高，進(jìn)入后熟期后酶活開始迅速提高，并保持穩(wěn)定，在子實(shí)體成熟期胞外淀粉酶活性達(dá)到最大，其中600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料活性最大值為15.97 U/g，其后分別為900 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，采摘子實(shí)體后開始逐漸下降。不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶活性變化規(guī)律總體相近。

2.6 不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)平菇子實(shí)體鋅含量的影響

不同質(zhì)量濃度Zn2+影響著Zn2+在平菇子實(shí)體中的分布。

表1 不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)平菇子實(shí)體鋅含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of zinc on the distribution of zinc in the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus

由表1可知，隨著Zn2+質(zhì)量濃度的增加，菌蓋、菌柄的Zn2+含量均逐步增加。Zn2+質(zhì)量濃度為0～600 mg/kg時(shí)，菌柄中Zn2+含量小于菌蓋；而Zn2+質(zhì)量濃度在900 mg/kg時(shí)，菌柄Zn2+含量逐漸高于菌蓋。

3 結(jié)論與討論

食用菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶[14]，這些酶與食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育和培養(yǎng)料的降解息息相關(guān)[15]，目前，已有一些學(xué)者對(duì)這些酶的變化規(guī)律展開研究。安琪等[16]和胡素娟等[17]以棉籽殼、玉米芯等基質(zhì)發(fā)酵料栽培平菇，發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)配方不影響平菇胞外酶活性的變化趨勢(shì)，但影響酶活性的高低。吳周斌等[18]研究了不同培養(yǎng)料對(duì)真姬菇胞外酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)料中真姬菇菌絲分泌的同種胞外酶，其活性在各生長(zhǎng)發(fā)育階段不同。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)金屬離子作為食用菌生長(zhǎng)所必需的微量元素，在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育中也起著重要作用。文晴等[19]以平菇為試材，分別采用平板培養(yǎng)法和棉籽殼熟料袋栽法，研究了鉀元素不同添加量對(duì)平菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響，表明隨著鉀元素添加量的增加，平板培養(yǎng)平菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)和長(zhǎng)速均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，棉籽殼熟料栽培平菇菌絲長(zhǎng)速和生物學(xué)效率也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。孔維威等[20]研究了銅對(duì)平菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響，表明Cu對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)、原基誘導(dǎo)時(shí)間、產(chǎn)量、子實(shí)體氨基酸、蛋白質(zhì)、粗脂肪含量的影響具有顯著的濃度效應(yīng)。鋅是人體必需微量元素，富鋅食用菌成為人們迫切需求的保健美食，富鋅食用菌的栽培也已經(jīng)提上日程。曾健勇等[7]研究了鋅對(duì)大球蓋菇富集液體培養(yǎng)的影響，表明適宜濃度的鋅富集液體培養(yǎng)可以顯著提高大球蓋菇菌絲產(chǎn)量、菌絲活性物質(zhì)產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率。本研究通過(guò)在袋料培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的鋅，考察菌體生長(zhǎng)及培養(yǎng)基中纖維素酶、木聚糖酶、濾紙酶、淀粉酶活性的變化情況，為工廠化富鋅栽培平菇提供最直接的數(shù)據(jù)。

本研究通過(guò)向秸稈基質(zhì)中添加不同濃度的Zn2+，研究結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)平菇分泌的同種胞外酶，其活性在各生長(zhǎng)發(fā)育階段不同，但不影響平菇胞外酶活性的變化趨勢(shì)，這與吳周斌等[18]的研究結(jié)果相同。在平菇生長(zhǎng)的前4個(gè)時(shí)期，胞外酶活性均很低，表明平菇在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)至原基分化初期主要降解半纖維素，而在伸長(zhǎng)期胞外酶活迅速提高，表明子實(shí)體形成期主要降解纖維素，可見平菇胞外酶活性與其生長(zhǎng)發(fā)育階段密切相關(guān)，并且呈現(xiàn)階段性變化。不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)平菇胞外酶活性有較大影響，本研究中添加的600 mg/kg Zn2+，有效促進(jìn)了平菇胞外酶的分泌，對(duì)平菇的富鋅栽培具有一定的指導(dǎo)意義。