唐 賢，丁 祥，朱 淼，宋志強(qiáng)，侯怡鈴*

（1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009）

黑牛肝菌又稱銅色牛肝菌（Boletus aereus），屬牛肝菌科牛肝菌屬，主要分布于四川、貴州、云南、歐洲等地[1]，高蛋白、低脂肪、低熱量，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，具有極高的商業(yè)價值[2]，近年，其多糖類成分的研究引起了人們的關(guān)注。目前對于黑牛肝菌多糖的研究主要集中于其分離純化、抗氧化及降血脂活性[4-6]，對黑牛肝菌多糖的體外抗腫瘤活性研究未見報道。本文參考文獻(xiàn)方法[7]提取純化黑牛肝菌多糖，并采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)表征其結(jié)構(gòu)，并研究其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以冀為黑牛肝菌多糖的深入研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1901/1900 系列傅立葉紅外光譜儀（Thermo Fisher Scientific）；BPN-80CH（UV）CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；96孔板（Corning）； SE-CJ-1F型超凈工作臺 （蘇州安泰）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A（上海亞榮生化儀器廠）；水浴鍋（上海光地）。

1.2 材料

黑牛肝菌（Boletus aereus）子實體采集于四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣，洗凈，置60 ℃烘箱烘干，保存于西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點實驗室。

1.3 試劑

DEAE-52纖維素柱（上海源葉生物）；透析袋（截留分子量≥7000 Da）（Biosharp 生物科技）；葡聚糖凝膠Sephadex G-200（Solarbio）；NaOH（天津津北）； NaCl，濃硫酸，濃鹽酸（成都科?。?；苯酚（四川航嘉）；無水乙醇[上緯精細(xì)化工（上海）公司]，以上試劑均為分析純。RPMI-1640 培養(yǎng)基，雙抗，胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）；脂多糖（LPS，Sigma）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8試劑盒）[博升生物科技（上海）]。

2 方法

2.1 黑牛肝菌多糖提取與純化

精確稱取黑牛肝菌子實體100 g，置60 ℃烘箱烘干，粉碎，細(xì)粉經(jīng)熱水（96 ℃）浸提，濃縮，乙醇沉淀（1:4），Sevag 法脫蛋白，60 ℃低溫干燥等步驟后，得粗多糖。將粗多糖加蒸餾水溶解，取5 ml加入活化平衡好的DEAE-52纖維素柱，用0.01 mol/L氯化鈉溶液過柱，流速為5 ml/min，收集500 ml洗脫液。洗脫多糖采用硫酸-苯酚法測定。將洗脫液濃縮至5 ml，置于透析袋中，并用蒸餾水持續(xù)透析2 d，每隔8 h換一次蒸餾水，透析后洗脫液冷凍干燥[8]，得到純化后的黑牛肝菌多糖（BA-1）。

2.2 BA-1結(jié)構(gòu)初步表征

稱取BA-1 3 mg，將其與適量干燥的 KBr研磨混勻后壓片，進(jìn)行FT-IR分析，波數(shù)范圍4000～400 cm-1。稱取BA-1 10 mg，溶于600 μl D2O，并在核磁共振儀上記錄1H NMR數(shù)據(jù)。

2.3 BA-1對3種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8法）測定BA-1對MFC細(xì)胞，CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞增殖的抑制作用。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，用1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋至1×105CFU/ml，吸取細(xì)胞懸液100 μl至96孔板，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，加入不同質(zhì)量濃度的BA-1溶液（最終質(zhì)量濃度為2.5，5，10，20，25 μg/ml）100 μl；陽性對照組每孔加入 LPS溶液（最終質(zhì)量濃度5 μg/ml）100 μl，空白組每孔加入完全培養(yǎng)液100 μl。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別向每孔加入CCK-8 5 μl，置CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀（450 nm）檢測。按以下公式計算細(xì)胞抑制率。

式中，P為細(xì)胞抑制率；A1為空白組平均吸光度值；A2為實驗組平均吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 FT-IR分析

采用OMNIC 8.2軟件處理分析BA-1的FT-IR光譜。BA-1的FT-IR光譜圖在4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有典型的吸收峰（見圖1）：3700～3100 cm-1范圍內(nèi)的寬吸收峰為O-H伸縮振動，3010～2850 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為-C-H， -CH2，-CH3伸縮振動，1800～1600 cm-1為 C=O，C=C伸縮振動峰，1200～1000 cm-1為糖類 C-O伸縮振動峰，620.41 cm-1的峰被指定為 C-H伸縮振動峰。FT-IR數(shù)據(jù)顯示，BA-1的多糖特征峰明顯，無其他雜質(zhì)峰，為均一多糖。

圖1 黑牛肝菌多糖FT-IR圖譜

3.2 1H NMR分析

采用MestReNova軟件處理BA-1的1H NMR圖譜，見圖2。δ4.70和δ4.67分別為水和D2O的氫信號。BA-1的1H NMR（400 MHz）波譜分為兩部分：（1）異頭氫區(qū)，δ5.90～4.30；（2）環(huán)質(zhì)子區(qū)，δ4.40～δ3.00[9]。BA-1有4個異頭氫，δ值分別為5.02，4.99，4.98，4.91，一般認(rèn)為吡喃糖殘基的α構(gòu)型異頭氫的δ＞5.00，β構(gòu)型異頭氫的δ＜5.00[10]。這表明BA-1至少由4個單糖組成，且不僅含α構(gòu)型吡喃糖，還可能含β構(gòu)型吡喃糖。

圖2 黑牛肝菌多糖的1H NMR圖譜

3.3 黑牛肝菌多糖對MFC細(xì)胞增殖的抑制作用

MFC細(xì)胞是小鼠胃癌細(xì)胞系，貼壁生長。用不同質(zhì)量濃度的黑牛肝菌多糖溶液刺激MFC細(xì)胞，結(jié)果見圖3。與空白組相比，LPS可極顯著抑制MFC細(xì)胞增殖（P＜0.01）；BA-1濃度為5～20 μg/ml時可在一定程度上抑制MFC細(xì)胞增殖。與空白組相比，當(dāng)BA-1濃度為10，15 μg/ml時，對MFC細(xì)胞有極顯著抑制作用（P＜0.01）；BA-1濃度為20，25 μg/ml時，能顯著抑制MFC細(xì)胞增殖（P＜0.05），BA-1濃度為15 μg/ml時對MFC細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯，抑制率為30.68 %。

圖3 黑牛肝菌多糖對MFC細(xì)胞增殖的抑制作用

3.4 黑牛肝菌多糖對S180細(xì)胞增殖的抑制作用

S180細(xì)胞為小鼠 Ehrlich 腹水腫瘤細(xì)胞，以半懸浮生長。用不同質(zhì)量濃度的黑牛肝菌多糖溶液刺激S180細(xì)胞（見圖4）。與空白組相比，LPS能極顯著抑制S180細(xì)胞增殖（P＜0.01）；BA-1濃度為2.5～25 μg/ml時，對S180細(xì)胞增殖有極顯著的抑制作用（P＜0.01），BA-1濃度為15 μg/ml時對S180細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯，抑制率為32.68 %。

圖4 黑牛肝菌多糖對S180細(xì)胞增殖的抑制作用

3.5 BA-1對CT26.WT細(xì)胞增殖的抑制作用

CT26.WT細(xì)胞為小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，貼壁生長。用不同濃度的BA-1溶液刺激CT26.WT細(xì)胞，結(jié)果見圖5。與空白組相比，LPS 能顯著抑制CT26.WT細(xì)胞增殖（P＜0.05）；BA-1濃度為2.5～20 μg/ml時，均能抑制CT26.WT細(xì)胞增殖（P＜0.01），BA-1濃度為15 μg/ml時對CT26.WT細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯，抑制率為38.90 %。

圖5 黑牛肝菌多糖對CT26.WT細(xì)胞增殖的抑制作用

4 結(jié)論

本文以四川省小金縣野生黑牛肝菌為研究對象，采用熱水浸提法、DEAE-52 纖維素柱層析法等分離純化得到黑牛肝菌多糖BA-1。采用FT-IR、1H NMR測定BA-1結(jié)構(gòu)，F(xiàn)T-IR分析顯示有明顯的多糖結(jié)構(gòu)特征吸收峰，1H NMR圖譜顯示BA-1至少由4個單糖組成。

用不同濃度的黑牛肝菌多糖BA-1分別刺激MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞，探究BA-1對腫瘤細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，與空白組相比，BA-1能在一定程度上抑制MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和 S180細(xì)胞增殖，BA-1濃度為15 μg/ml時對MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯，分別為30.68 %，32.68 %和38.90 %。

綜上，在體外實驗中，黑牛肝菌多糖BA-1在一定程度上抑制MFC、 CT26.WT和S180 3種腫瘤細(xì)胞的增殖。BA-1是一類大分子物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)鑒定還需進(jìn)一步研究。本文為后續(xù)BA-1的結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。