曲星怡 黃登禹 孫永健* 班立桐 曹青青

（1天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津301700；2天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與蛹的復(fù)合體[1-3]。目前蛹蟲草的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)中，多以大米作為主要的栽培基質(zhì)[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的大米培養(yǎng)基中含有豐富的蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等功效成分，以及未被完全利用的大米蛋白、淀粉、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，可以作為食品、醫(yī)藥、化工等工業(yè)生產(chǎn)的原料[6-9]。近年來，許多學(xué)者利用采收蛹蟲草子實(shí)體之后的大米培養(yǎng)基（長(zhǎng)滿菌絲體）為原料，開發(fā)出保健黃酒、功能食醋、風(fēng)味醬油、焙烤食品等，在提高產(chǎn)品附加值、減少農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)環(huán)境污染的同時(shí)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的保健需求[10-14]。但蛹蟲草栽培基質(zhì)中除大米外，通常會(huì)輔以其他碳源、氮源、無機(jī)鹽等成分，加之生物富集作用[15-20]。因此，需對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化，在保證子實(shí)體產(chǎn)量及品質(zhì)的同時(shí)，降低化學(xué)污染物殘留。研究為提高蛹蟲草栽培基質(zhì)作為原料進(jìn)行食品開發(fā)時(shí)的安全性，為擴(kuò)大其應(yīng)用前景提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

蛹蟲草菌種為天津天獅學(xué)院生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、VB1等均為分析純，購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；大米、黃豆、蠶蛹粉、玉米淀粉等為市場(chǎng)采購(gòu)。

光照培養(yǎng)箱（GZX-150BS）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（KYC-100B）：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-78A）：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；RZ-2D2G雙人桌面（水平）凈化工作臺(tái)：廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 栽培種制備

稱取馬鈴薯300 g，去皮后切成小塊，加500 mL蒸餾水煮沸30 min，用四層紗布過濾取濾液。向?yàn)V液中加入 MgSO41.5 g，KH2PO43 g，VB110 mg，葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1000 mL，分裝后于121℃下滅菌20 min。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，挑取綠豆粒大小的蛹蟲草菌原種，接種于上述液體培養(yǎng)基中。于搖床內(nèi)進(jìn)行避光振蕩培養(yǎng)，溫度為22℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，3 d后選出菌液澄清、菌球長(zhǎng)勢(shì)一致且無畸形的栽培種繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.2.2 培養(yǎng)基配方試驗(yàn)

在前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用基礎(chǔ)基質(zhì)用量為15 g/瓶，料液比為1∶1.2，栽培種接種量為8 mL/瓶的方案進(jìn)行培養(yǎng)基的配制與接種。為提升栽培基質(zhì)作為食品原料進(jìn)行開發(fā)時(shí)的利用價(jià)值，向常見的大米培養(yǎng)基中添加適量的黃豆或帶麩皮的小麥，配方見表1，進(jìn)行基礎(chǔ)基質(zhì)優(yōu)選時(shí)，培養(yǎng)料中的營(yíng)養(yǎng)液每升含 有蛋白胨 8 g，蔗糖 7 g，KH2PO41 g，VB10.01 g。為提升栽培基質(zhì)的食用安全性，基礎(chǔ)基質(zhì)選定后，再對(duì)營(yíng)養(yǎng)液中的碳源、氮源及其他添加物進(jìn)行優(yōu)選，以期利用更安全的食品級(jí)的碳源、氮源、維生素來替代栽培中常用的蔗糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4等化學(xué)試劑，配方見表2，表3和表4。每個(gè)處理進(jìn)行5個(gè)重復(fù)。

表1 基礎(chǔ)基質(zhì)配方

表2 碳源的種類及配比

表3 氮源的種類及配比

表4 其他添加物種類及配比

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在1.2.2的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)對(duì)基礎(chǔ)基質(zhì)的配比、營(yíng)養(yǎng)液中的碳源、氮源和VC這4個(gè)因素進(jìn)行3水平的設(shè)計(jì)。其中，L9（34）的9組正交試驗(yàn)中因素與水平的設(shè)計(jì)見表5。以蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量為指標(biāo)，優(yōu)化栽培基質(zhì)配方。

表5 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4 栽培管理

接種好的培養(yǎng)基，于室溫17℃避光培養(yǎng)，空氣相對(duì)濕度保持在65%～75%，待培養(yǎng)基表面布滿菌絲后將溫度調(diào)整為24℃，直至菌絲深入瓶底，吃透培養(yǎng)基。然后進(jìn)行晝夜溫差培養(yǎng)，日間給予600 lx的光照12 h，溫度為22℃，夜間避光12 h，溫度為16℃，空氣相對(duì)濕度保持在60%～70%，培養(yǎng)10 d后開始形成原基。隨后晝夜給予600 lx的光照，溫度固定在22℃，空氣相對(duì)濕度保持在85%～90%，適當(dāng)擰松瓶蓋，提高空氣流通性，促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)。當(dāng)子實(shí)體尖端稍有膨大時(shí)，即可采收。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)基質(zhì)配方對(duì)蛹蟲草培育的影響

按照一定比例向基礎(chǔ)基質(zhì)中添加黃豆比、添加小麥能夠明顯縮短蛹蟲草的栽培用時(shí)，最多相差4.2 d。且隨著黃豆添加比例的增加，栽培時(shí)間逐漸縮短，當(dāng)添加比例達(dá)到20%時(shí)，栽培時(shí)間最短，平均耗時(shí)58.2 d。繼續(xù)提高黃豆添加比例，栽培時(shí)間不降反升。添加小麥的栽培基質(zhì)，蛹蟲草栽培時(shí)間隨小麥添加量的增加也逐漸縮短，但不如添加黃豆明顯。添加小麥對(duì)蛹蟲草生物學(xué)效率的影響并不大，平均生物學(xué)效率最高為94.6%。而黃豆的添加對(duì)蛹蟲草生物學(xué)效率有一定影響，平均生物學(xué)效率最高為95.3%。添加黃豆可豐富栽培基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分，增加植物蛋白含量，提高栽培基質(zhì)作為食品原料進(jìn)行開發(fā)時(shí)的利用價(jià)值。因此，向大米培養(yǎng)基中添加20%的黃豆為基礎(chǔ)基質(zhì)的較優(yōu)配方。

表6 采用不同配方基礎(chǔ)基質(zhì)時(shí)蛹蟲草的栽培用時(shí)及生物學(xué)效率（n=5）

2.2 碳源對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響

3種碳源均可被蛹蟲草菌所利用，但碳源種類及添加量會(huì)對(duì)子實(shí)體的鮮重產(chǎn)生影響且存在差異。其中，以綿白糖（C2組）及玉米淀粉（C3組）為碳源的各處理，子實(shí)體鮮重均低于以蔗糖（C1組）為碳源的各處理，無論以何種比例添加，蛹蟲草菌更容易利用蔗糖。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中的蔗糖與綿白糖添加量為9 g/L時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體鮮重最大，分別為14.2 g/瓶與14.1 g/瓶，兩者相差并不大。考慮到采收子實(shí)體后栽培基質(zhì)將作為食品原料進(jìn)行開發(fā)，因此確定綿白糖為較優(yōu)碳源，營(yíng)養(yǎng)液中的添加量為9 g/L。

表7 采用3種碳源以不同比例添加至栽培基質(zhì)后蛹蟲草的產(chǎn)量（n=5）

2.3 氮源對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響

以奶粉為氮源的各處理（N31，N32，N33，N34），蛹蟲草子實(shí)體鮮重均低于以蛋白胨及蠶蛹粉為氮源的各處理。以蛋白胨為氮源時(shí)，該試驗(yàn)組中的各處理（N11，N12，N13，N14）對(duì)蛹蟲草的產(chǎn)量影響不明顯。以蠶蛹粉為氮源時(shí)，隨著添加量的上升，子實(shí)體鮮重不斷增加，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中添加量為35 g/L時(shí)，子實(shí)體鮮重最高為14.4 g/瓶。雖然添加蠶蛹粉相比于蛋白胨會(huì)增加蛹蟲草的培養(yǎng)成本，但可以提高子實(shí)體的產(chǎn)量與品質(zhì)，且在利用采收子實(shí)體后的栽培基質(zhì)作為原料開發(fā)食品時(shí)，可提升產(chǎn)品的食用安全性，豐富產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分。綜合考慮，確定蠶蛹粉為較優(yōu)氮源，營(yíng)養(yǎng)液中的添加量為35 g/L。

表8 采用3種氮源以不同比例添加至栽培基質(zhì)后蛹蟲草的產(chǎn)量（n=5）

2.4 其他添加物對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的影響

單從蛹蟲草生長(zhǎng)的各階段來看，S11處理的栽培基質(zhì)，適于子實(shí)體的生長(zhǎng)，所需時(shí)間最短，為32.4 d，S12處理的栽培基質(zhì)，適于菌絲轉(zhuǎn)色及子座原基的形成，所需時(shí)間最短，分別為4.2 d與9.8 d。S13處理的栽培基質(zhì)，適于菌絲體的生長(zhǎng)，所需時(shí)間最短，為8.8 d。從蛹蟲草生長(zhǎng)的整個(gè)過程來看，添加KH2PO4的栽培基質(zhì)中（S11，S12），蛹蟲草的生長(zhǎng)呈先慢后快，其中，S12處理添加了MgSO4，縮短了菌絲轉(zhuǎn)色、子座原基形成所需時(shí)間，栽培蛹蟲草耗時(shí)最短，為56.8 d。添加VC的栽培基質(zhì)（S13）相比S11、S12處理，雖后期蛹蟲草生長(zhǎng)趨緩，但整體栽培耗時(shí)仍低于S11處理，為57.2 d，僅高于S12處理0.4 d。綜合考慮向營(yíng)養(yǎng)液中添加0.1 g/L的VC為較優(yōu)的處理。

表9 含有不同添加物的栽培基質(zhì)中蛹蟲草各生長(zhǎng)階段所需時(shí)間（n=5）

2.5 栽培基質(zhì)的優(yōu)化

以每瓶中子實(shí)體鮮重為指標(biāo)，對(duì)基礎(chǔ)基質(zhì)的配比、營(yíng)養(yǎng)液中的碳源、氮源和VC的添加量進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明（表9），影響蛹蟲草子實(shí)體鮮重的主次因素排序?yàn)?，蠶蛹粉＞黃豆＞VC＞綿白糖?？疾爝@幾個(gè)因素在3個(gè)水平上的變化，確定較優(yōu)方案為C3A2D2B3，即基礎(chǔ)基質(zhì)的組成及配比為大米80%+黃豆20%，營(yíng)養(yǎng)液中蠶蛹粉、VC、綿白糖的添加量分別為40 g/L、0.1 g/L、12 g/L。

表10 正交試驗(yàn)直觀分析表

在對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析時(shí)，選取綿白糖B作為誤差項(xiàng)，在α=0.05的條件下進(jìn)行F檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果表明（表10），蠶蛹粉、黃豆、VC對(duì)蛹蟲草子實(shí)體的鮮重具有顯著性影響，三者變化對(duì)蛹蟲草的產(chǎn)量影響較大。

以較優(yōu)方案培養(yǎng)蛹蟲草，驗(yàn)證其可靠性，結(jié)果表明（表11），子實(shí)體鮮重比9組正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)當(dāng)中的最大值還高，最高達(dá)到15.1 g/瓶，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.05%，進(jìn)一步驗(yàn)證了正交試驗(yàn)得出的較優(yōu)方案。

表11 正交試驗(yàn)方差分析

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在目前應(yīng)用比較成熟的蛹蟲草大米栽培基質(zhì)中適當(dāng)添加黃豆和帶麩皮的小麥，可以在不影響蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量的前提下，縮短栽培時(shí)間，且提升栽培基質(zhì)本身作為食品生產(chǎn)原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)，黃豆可以提高蛹蟲草的生物學(xué)效率，從而提高對(duì)栽培基質(zhì)的利用率，這可能是由于黃豆中富含的蛋白質(zhì)，改善了栽培基質(zhì)中的碳氮比，使其更適于蛹蟲草的生長(zhǎng)；以綿白糖作為碳源，以蠶蛹粉作為氮源添加于營(yíng)養(yǎng)液中，相比于常規(guī)蔗糖、蛋白胨來說，可以在不影響蛹蟲草產(chǎn)量、保證品質(zhì)的前提下，提高了后續(xù)利用栽培基質(zhì)作為食品原料開發(fā)利用安全性；VC的加入使得初始pH更適于蛹蟲草的生長(zhǎng)，但對(duì)栽培基質(zhì)的緩沖作用不如KH2PO4好，因此蛹蟲草的后期生長(zhǎng)變慢，但整體效果仍優(yōu)于KH2PO4。后續(xù)的研究可以尋找一種既可以為栽培基質(zhì)提供較好緩沖作用，又能提供無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)作用的更安全的添加物。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，最終確定適于作為食品生產(chǎn)原料的蛹蟲草栽培基質(zhì)配方為，基礎(chǔ)基質(zhì)為大米80%，黃豆20%，以1∶1.2的料液比添加營(yíng)養(yǎng)液、碳源、氮源及其他添加物的較優(yōu)配方為綿白糖12 g/L，蠶蛹粉40 g/L，VC 0.1 g/L，VB10.01 g/L。