張東軍，吳文斌#，涂玲麗，劉志國，杜景云

宜都市中醫(yī)醫(yī)院1耳鼻喉科，2腫瘤科，3病理科，湖北 宜都443300

喉癌是頭頸部腫瘤中一種常見的腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，是惡性程度最高的腫瘤之一[1-2]。喉癌的病死率在醫(yī)療系統(tǒng)發(fā)達的國家中逐年下降，但在發(fā)展中國家仍然較高[3]。此外，喉癌引起的一系列并發(fā)癥包括呼吸困難、咳嗽、吞咽困難等問題嚴重影響著患者的生活質(zhì)量及疾病預后[4]，而且分級較高的喉癌患者的診斷和治療仍存在較多的臨床難題[1,5-7]。因此，闡明喉癌的分子發(fā)病機制對于尋找新的治療策略非常重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，長度為20～23個核苷酸[8]，通過特異性結(jié)合或切割信使RNA（messenger RNA，mRNA）或抑制其翻譯發(fā)揮基因表達調(diào)控的重要作用[9]。針對喉癌基因組的了解有助于找到新的治療靶點并了解該疾病的分子病理學。在人喉癌研究中，已有報道多種miRNA在疾病進展過程中的異常表達[5,10-12]。有研究表明，miRNA-29a-3p在胃癌中可抑制腫瘤細胞的增殖[13]，但其在喉癌中的作用尚不清楚。本研究通過檢測喉癌組織和細胞系中miRNA-29a-3p的表達情況及其對喉癌細胞系增殖和凋亡的影響，證實miRNA-29a-3p在喉癌中的作用。另外，在前期工作中，通過數(shù)據(jù)庫篩查發(fā)現(xiàn)prominin 1（PROM1）可能是miRNA-29a-3p的潛在靶基因。因此在本研究中將進一步通過生物信息學分析并驗證miRNA-29a-3p與PROM1的靶向作用，從而為喉癌的診斷治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

正常的鼻咽上皮細胞系NP69以及喉癌細胞系TU212、M4E、M2E和HEP-2均購自中國科學院上海分院細胞庫。喉癌細胞系在低糖的DMEM培養(yǎng)基（購自美國Invitrogen公司）中培養(yǎng)，補充含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購自美國Hy-Clone公司）和1%青霉素/鏈霉素（購自美國Invitrogen公司）；正常鼻咽上皮細胞系NP69在含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所有細胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）檢測miRNA-29a- 3 p表達情況

使用Trizol試劑（購自美國Invitrogen公司）按照說明書從細胞中提取總RNA。之后，取出2 μg RNA并用DNA酶處理，去除污染的DNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Promega公司）將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用RNASYBR?PCR Kit試劑盒（購自日本Toyobo公司）定量檢測miRNA-29a-3p（上游引物：5'-UAAUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'；下游引物：5'-GUUGAGGUGAUGTUGGU-3'）；以U6為內(nèi)參（上游引物：5'-UGACUUCAACAGCGACACCCA-3'；下游引物：5'-CACCCUGUUGCUGUAGCCAAA-3'）。定量反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s、60℃退火延伸30 s、72℃延伸30 s，36個循環(huán)。以U6為內(nèi)參計算2-ΔΔCt值，并將所有數(shù)據(jù)根據(jù)內(nèi)參對照進行標準化，比較各組miRNA-29a-3p表達差異。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組

①空白對照組（mimic-NC組）：轉(zhuǎn)染mimic-NC質(zhì)粒。②miRNA-29a-3p上調(diào)組（miRNA-29a-3p mimic組）：僅轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒。③miRNA-29a-3p及PROM1的空白對照組（mimic-NC+oe-NC組）：同時轉(zhuǎn)染mimic-NC質(zhì)粒及oe-NC質(zhì)粒。④僅上調(diào)miRNA-29a-3p而不上調(diào)PROM1組（miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組）：同時轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒及oe-NC質(zhì)粒。⑤同時上調(diào)miRNA-29a-3p和PROM1組（miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組）：同時轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒及oe-PROM1質(zhì)粒。操作方法如下：轉(zhuǎn)染前24 h，將細胞按2×105/孔接種在6孔板中，待細胞融合度達到50%時，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（購自美國Invitrogen公司）說明書，將終濃度為100 nmol/L的相應質(zhì)粒（均購自廣州銳博生物科技有限公司）分別轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后6 h加入20%FBS。

1.4 集落形成實驗檢測細胞克隆形成率

在6孔板中每孔加入2 ml 0.6%底層瓊脂糖（購自美國GIBCO公司），待底層瓊脂糖凝固后，將細胞均勻懸浮于37℃、0.3%瓊脂糖中，并迅速把2 ml細胞懸液加到6孔板底層瓊脂糖上（2000/孔），置于4℃10 min。再在37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14天，然后在顯微鏡下對形成的克隆計數(shù)（≥50個細胞為1個克?。?，計算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。實驗設(shè)3個平行孔，取平均值。

1.5 噻唑藍法檢測細胞增殖活性

采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞的增殖情況。將細胞按2×103/孔接種至96孔板中，每組樣本6個復孔。分別在24、48、72 h向各孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。溫育后，棄去上清液，向各孔中加入150 μl二甲基亞砜，置于搖床輕微振蕩，直至晶體完全溶解。使用多功能酶標儀在450 nm處測量吸光度（optical density，OD）值，比較各時間點細胞增殖能力。實驗重復3次，取平均值。

1.6 熒光素酶實驗測定miRNA-29a- 3 p與PROM 1的靶向關(guān)系

為了檢測miRNA-29a-3p對PROM13'-UTR的影響，本研究構(gòu)建了含有部分PROM13'-UTR的熒光素酶表達載體。PROM1mRNA的野生型片段含有潛在的miRNA-29a-3p結(jié)合位點（UGGUGCU），故使用下述引物：5'-CTGAGTTTCTATTTAGACACTACAACA-3'（正向）和5'-ACAATTTGACATGTGGCATTAACG-3'（反向）進行擴增。使用KpnI/XhoI限制性內(nèi)切核酸酶將PCR片段插入pGL4 Basic Vector。使用突變試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）進行PROM13'-UTR的突變，將UGGUGCU結(jié)合位點突變?yōu)锳CCACGA。螢光素酶活性測定，將細胞用100 ng野生型或突變型PROM1的3'-UTR質(zhì)粒與100 ng miRNA-29a-3p共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后48 h，使用熒光素酶測定試劑盒（購自美國Promega公司）測定熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參歸一處理。

1.7 Westernblot法檢測PROM 1及GAPDH蛋白表達情況

細胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基并用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，細胞使用RIPA蛋白裂解液進行裂解（添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑），收集裂解細胞至1.5 ml EP管中，利用超聲破碎儀對細胞進行徹底破碎。冰上放置5 min充分裂解后，13 000 r/min、4℃離心20 min，取上清至新的EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣本使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離；使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上；5%脫脂牛奶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20緩沖液（trihydroxymethyl aminomethane hydrochloride buffered solution with Tween 20，TBS-T）溶液封閉1 h；按比例稀釋一抗PROM1及內(nèi)參GAPDH并過夜孵育；PBS-T溶液洗膜并室溫下孵育相應的二抗1 h；最后充分洗膜完成后，使用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液進行曝光成像。實驗重復3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各細胞中miRNA-29a- 3 p相對表達量的比較

正常NP69細胞、TU212細胞、M4E細胞、M2E細胞和HEP-2細胞的miRNA-29a-3p相對表達量分別為（2.38±0.07）、（0.31±0.03）、（1.21±0.06）、（1.13±0.07）、（0.55±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（F=577.121，P＜0.01）；TU212細胞、M4E細胞、M2E細胞和HEP-2細胞的miRNA-29a-3p相對表達量均明顯低于正常NP69細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（t=7.583、4.672、5.036、6.129，P＜0.01）。除正常NP69細胞外，選擇相對表達量最低的TU212細胞作為受試細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 上調(diào)miRNA-29a- 3 p表達對PROM 1蛋白表達情況的影響

Western blot法檢測顯示，miRNA-29a-3p mimic組TU212細胞PROM1蛋白相對表達量為（0.448±0.075），明顯低于mimic-NC組的（1.135±0.106），差異有統(tǒng)計學意義（t=14.964，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot法檢測mimic-NC組和miRNA-29a- 3 p mimic組TU212細胞中PROM 1蛋白表達情況

2.3 熒光素酶活性的比較

經(jīng)熒光素酶系統(tǒng)驗證，轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p后，野生型PROM1的熒光素酶活性為（0.627±0.089），明顯低于mimic-NC組的（1.000±0.103），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.750，P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p后，突變型PROM1的熒光素酶活性為（0.985±0.107），與mimic-NC組的（1.000±0.112）比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.274，P＞0.05）。

2.4 miRNA-29a- 3 p調(diào)控PROM 1對喉癌細胞增殖能力的影響

miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組細胞克隆形成率低于mimic-NC+oe-NC組和miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；mimic-NC+oe-NC組與miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組細胞克隆形成率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖2、表1）

miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組細胞各時間點OD值均低于mimic-NC+oe-NC組和miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；mimic-NC+oe-NC組與miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組各時間點OD值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

圖2 各組喉癌細胞克隆形成實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×200）

表1 各組喉癌細胞增殖情況的比較（± s）

表1 各組喉癌細胞增殖情況的比較（± s）

注：a與mimic-NC+oe-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組比較，P＜0.05

組別mimic-NC+oe-NC組miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組F值P值克隆形成率（%）0.97±0.072 0.41±0.045a 0.93±0.067b 200.24 0.000 OD值24 h 0.72±0.03 0.46±0.03a 0.79±0.03b 10.360 0.027 48 h 2.14±0.07 1.57±0.08a 2.37±0.07b 16.730 0.018 72 h 2.83±0.11 1.98±0.12a 3.02±0.11b 24.510 0.006

3 討論

在喉癌中發(fā)現(xiàn)了許多miRNA轉(zhuǎn)錄后水平可調(diào)節(jié)基因表達[14-15]，然而，仍有未知的miRNA。已有的研究中指出了miRNA-29a-3p在某些類型的腫瘤中是腫瘤抑制性miRNA[16]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常鼻咽細胞系相比，miRNA-29a-3p在喉癌細胞系中的表達顯著下調(diào)。在喉癌細胞中上調(diào)miRNA-29a-3p表達可顯著降低細胞增殖能力及細胞克隆能力。PROM1是一種致癌基因，被證實是喉癌細胞中miRNA-29a-3p的直接靶基因。在本研究亦證實PROM1是miRNA-29a-3p的靶向基因，且在TU212細胞中上調(diào)PROM1表達可明顯逆轉(zhuǎn)miRNA-29a-3p對喉癌細胞增殖的抑制作用，證明miRNA-29a-3p通過靶向PROM1抑制喉癌細胞增殖，這表明miRNA-29a-3p作為腫瘤抑制性miRNA發(fā)揮作用。

大多數(shù)先前的研究表明，miRNA-29a-3p在膠質(zhì)細胞瘤及肝癌中起著抑制腫瘤的作用[10,17]。miRNA-29-3p包括miRNA-29a-3p、miRNA-29b-3p和miRNA-29c-3p。本研究主要集中在miRNA-29a-3p，因為其在喉癌中表達水平較低，而且在喉癌細胞和正常細胞中miRNA-29b-3p和miRNA-29c-3p表達水平?jīng)]有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常細胞相比，喉癌細胞中miRNA-29a-3p的表達下調(diào)。針對miRNA-29a-3p的細胞功能研究，本研究證實了miRNA-29a-3p能夠降低喉癌細胞的細胞增殖能力、克隆形成率。因此，以上數(shù)據(jù)均表明miRNA-29a-3p在喉癌中發(fā)揮著抑制性miRNA的作用。

PROM1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[18]。PROM1是干細胞以及多種腫瘤的潛在診斷分子標志物[19-21]。在本研究中，證實了PROM1是miRNA-29a-3p的下游靶點，并且也是喉癌細胞中miRNA-29a-3p的功能介導因子。在PROM1的3'-UTR中存在miRNA-29a-3p的互補序列，本研究通過熒光素酶實驗證實正常的PROM13'-UTR會使熒光素酶的活性受到抑制，但miRNA-29a-3p對突變體PROM13'-UTR沒有影響。這表明miRNA-29a-3p可能與PROM13'-UTR結(jié)合，然后促進PROM1mRNA的降解并抑制PROM1的翻譯。

綜上所述，miRNA-29a-3p是一種喉癌抑制性的miRNA。miRNA-29a-3p通過調(diào)節(jié)PROM1影響人喉癌的發(fā)生和發(fā)展，可能是治療喉癌的潛在靶點，其在喉癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用可能有助于患者的診斷和預后。本研究結(jié)果為更好地了解喉癌的發(fā)病機制及其可能的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。