陸煬, 顏云蕎, 崔桂友*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.無(wú)錫國(guó)通環(huán)境檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 214101)

食品指紋圖譜從整體上研究食品物質(zhì)體系，是一種較為復(fù)雜的技術(shù)。其特點(diǎn)是利用指紋圖譜的特異性有效鑒別食品產(chǎn)地或真假，主要用于評(píng)價(jià)樣品的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。氣相色譜-質(zhì)譜法的指紋圖譜是建立在用氣體作為流動(dòng)相色譜分離并定量與用質(zhì)譜定性相聯(lián)用的分析方法。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜庫(kù)的比對(duì)分析及指紋圖譜相似度的計(jì)算得出重現(xiàn)性好、高效、有代表的樣品指紋圖譜。而指紋圖譜相似度的計(jì)算是基于對(duì)大量色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)方法處理的?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)是一門(mén)新興的化學(xué)分支科學(xué)，運(yùn)用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)以及其他相關(guān)學(xué)科的理論和方法，優(yōu)化化學(xué)量測(cè)過(guò)程，并通過(guò)解析化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)以最大限度地獲取化學(xué)及相關(guān)信息[1]。所以，可以對(duì)大量常規(guī)相似的數(shù)據(jù)高效地辨識(shí)，從而進(jìn)行定性、定量和質(zhì)量控制，解決了人工感官檢測(cè)所引起的抽象和主觀問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

揚(yáng)州鹽水鵝:購(gòu)于揚(yáng)州市邗江區(qū)黃玨鎮(zhèn)某攤位。采樣時(shí)間上午11∶00，鵝肉稱重后由攤主切成符合食用要求的薄塊，并裝入聚乙烯塑料袋中(攤主提供)。另取一袋倒入適量鹵汁備檢。摻兌實(shí)驗(yàn)所用摻兌樣為風(fēng)鵝，購(gòu)于揚(yáng)州歐尚超市，廠家為揚(yáng)州市霧中花食品工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

料理機(jī) 山東九陽(yáng)小家電有限公司；SPEM手動(dòng)進(jìn)樣手柄、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭、75 μm CAR/PDMS萃取頭、50/30 μm DVB/CAR-PDMS萃取頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；DSQ Ⅱ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海申生生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

試驗(yàn)材料為揚(yáng)州鹽水鵝(8個(gè)批次，編號(hào)為1～8)。鵝肉用料理機(jī)絞碎，取4 g放入15 mL樣品萃取瓶中，蓋上蓋子，冷藏待用。鹵水取定量直接分裝至15 mL樣品萃取瓶中，蓋上蓋子，冷藏待用。

將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化，老化溫度為250 ℃，載氣體積流量為0.8 mL/min，分流比為50∶1，老化時(shí)間為2 h。

利用手動(dòng)進(jìn)樣手柄將固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶中，恒溫45 ℃，推出萃取頭。吸附40 min，隨后拔出于氣相色譜儀進(jìn)樣。250 ℃解析2 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.2 儀器測(cè)定條件[2]

氣相色譜條件：毛細(xì)血管柱為DB-5MS柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速為0.8 mL/min，不分流，恒壓35 kPa，進(jìn)樣溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，起始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至130 ℃，無(wú)保留；再以8 ℃/min升溫至200 ℃，無(wú)保留；再以12 ℃/min升溫至250 ℃，保留15 min。

質(zhì)譜條件：EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍33～500 amu。

1.3.3 摻兌實(shí)驗(yàn)

取部分待測(cè)9號(hào)鹽水鵝樣品進(jìn)行摻兌實(shí)驗(yàn)，分別摻比風(fēng)鵝樣品0%、25%、50%、75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，編號(hào)為C1、C2、C3、C4。

1.3.4 定性方法

定性：化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST Library(107 k compounds)和Wiley Library(320 k compounds)相匹配。僅報(bào)道匹配度和純度大于800(最大值1000)的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜峰的匹配

本試驗(yàn)選用內(nèi)標(biāo)法對(duì)揚(yáng)州鹽水鵝中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，在樣品中添加2-乙?；拎?GR級(jí))，通過(guò)組分與內(nèi)標(biāo)峰的面積比，對(duì)組分進(jìn)行定量，該方法減少了手動(dòng)進(jìn)樣誤差對(duì)定量結(jié)果的影響。在相同試驗(yàn)條件下測(cè)定2-乙?；拎?，其保留時(shí)間約為11.98 min，其出峰位置、峰形、分離度和穩(wěn)定性均比較好；揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味物質(zhì)主要是碳?xì)溲醭煞?，所以?nèi)標(biāo)物2-乙?；拎づc分析目標(biāo)成分有類似的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)風(fēng)味組分定量效果較好；且樣品在該處沒(méi)有色譜峰，可以作為試驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)參考峰。以此參考峰求出其他所有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間α。以2-乙酰基吡啶出峰時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各峰進(jìn)行定位匹配。

計(jì)算公式：α=tri/trs。

式中：tri為待測(cè)峰的絕對(duì)保留時(shí)間；trs為內(nèi)標(biāo)參考峰的絕對(duì)保留時(shí)間。

2.2 指紋圖譜的建立與分析

對(duì)1～8號(hào)樣品進(jìn)行測(cè)定，從中選取了9個(gè)共有峰作為可以構(gòu)成揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味指紋圖譜的特征指紋峰。特征指紋峰的峰面積占總峰面積的35%以上，值得注意的是部分色譜圖中乙醇含量很高，相對(duì)峰面積超過(guò)50%，這可能是由于揚(yáng)州鹽水鵝在制作過(guò)程中添加的料酒量不同導(dǎo)致檢測(cè)數(shù)值不同，所以乙醇不能作為共有峰成為特征指紋峰。以數(shù)字編號(hào)的峰為揚(yáng)州鹽水鵝的指紋峰見(jiàn)圖1，S為內(nèi)標(biāo)物2-乙?；拎に龇澹?jù)此求出每一個(gè)標(biāo)樣特征峰的相對(duì)峰面積Sr值。以2-乙酰基吡啶的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各峰進(jìn)行定量匹配。

圖1 揚(yáng)州鹽水鵝標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of standard samples of Yangzhou salted goose

注：1～9號(hào)峰分別為己醛、C16H18NO2、己酸乙烯基酯、辛醛、芳樟醇、壬醛、癸醛、4-烯丙基苯甲醚、C10H12O2，S為2-乙酰基吡啶所出峰。

計(jì)算公式：Sr=Ai/As×100%。式中：Ai為特征峰的面積；As為內(nèi)標(biāo)參考峰的面積。

將樣品中的各組分的相對(duì)保留值α按從小到大的順序排列，找出共有特征峰的α值從小到大排列，得到表1。計(jì)算可得共有特征峰對(duì)應(yīng)的Sr值，見(jiàn)表2。由此可建立起揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

表1 1～8號(hào)樣品指紋圖譜中α值Table 1 The α values in fingerprint of 1～8 samples

表2 1～8號(hào)樣品指紋圖譜中Sr值Table 2 The Sr values in fingerprint of 1～8 samples

由表1和表2可知，揚(yáng)州鹽水鵝的主要風(fēng)味成分為碳?xì)溲醭煞?，其以醛類居多，醛類物質(zhì)閾值低且在醬腌肉中含量較高，是醬腌肉風(fēng)味形成極其重要的一類化合物。肉品揮發(fā)性風(fēng)味成分中的醛來(lái)源于脂肪氧化，其中辛醛(油脂清新氣息)和壬醛(脂肪香氣)是油酸氧化的產(chǎn)物[3]，己醛(清新香草香氣)是亞油酸的主要氧化產(chǎn)物[4]，其次還有醇類及雜環(huán)化合物類。含N的雜環(huán)化合物是對(duì)肉類風(fēng)味起主要作用的化合物之一，而醚類化合物也是重要的風(fēng)味物質(zhì)，特別是含有苯環(huán)的醚，大多數(shù)具有強(qiáng)烈而愉快的香氣。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的4-烯丙基苯甲醚很可能與所加香辛料八角茴香、大茴香等有關(guān)。

2.3 精確性實(shí)驗(yàn)

對(duì)3號(hào)標(biāo)樣連續(xù)進(jìn)行10次，按1.3.1操作及1.3.2儀器測(cè)定條件進(jìn)行分析，其特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值和特征峰的相對(duì)峰面積Sr值見(jiàn)表3和表4。

表3 精確性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值Table 3 The relative retention time α values of characteristic peaks in accuracy experiments

續(xù) 表

表4 精確性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)峰面積Sr值Table 4 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in accuracy experiments

由表3和表4可知，揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值的RSD均小于2%；且特征峰的相對(duì)峰面積Sr值的RSD也比較小，均低于3.5%。進(jìn)一步表明頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)精確性較高，與指紋圖譜檢測(cè)要求相符。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.3.1操作及1.3.2儀器測(cè)定條件進(jìn)行分析，取1～5號(hào)樣品分5次進(jìn)行試驗(yàn)，共計(jì)5 d，其特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值和特征峰的相對(duì)峰面積Sr值見(jiàn)表5和表6。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值Table 5 The relative retention time α values of characteristic peaks in repetitive experiments

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)峰面積Sr值Table 6 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in repetitive experiments

由表5可知，揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值的RSD值較小，均小于2%，說(shuō)明頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值有較好的重復(fù)性。由表6可知，揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味特征峰的相對(duì)峰面積Sr值的RSD值在1%～23%的范圍內(nèi)，表明頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)特征峰的相對(duì)峰面積Sr值的穩(wěn)定性一般，這可能與頂空固相微萃取處理方法有關(guān)。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取4號(hào)樣品，分別在制備后1，4，8，12，24，48 h進(jìn)樣，其特征峰相對(duì)保留時(shí)間α值和相對(duì)峰面積的Sr值見(jiàn)表7和表8。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值Table 7 The relative retention time α values of characteristic peaks in stability experiments

表8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)特征峰的相對(duì)峰面積Sr值Table 8 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in stability experiments

由表7和表8可知，揚(yáng)州鹽水鵝的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間α值的RSD值均小于2.5%，而相對(duì)峰面積Sr值的RSD值也比較小，均小于8.5%。表明頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)揚(yáng)州鹽水鵝風(fēng)味揮發(fā)性成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，與指紋圖譜檢測(cè)要求相符。

2.6 色譜指紋圖譜相似度計(jì)算與分析

指紋圖譜的特異性，能有效鑒別食品樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地，評(píng)價(jià)樣品的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。通過(guò)制定指紋圖譜，使特征峰的含量和比例可以達(dá)到控制食品質(zhì)量和確保食品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定的目的。而指紋圖譜相似度正是一種評(píng)價(jià)指紋圖譜穩(wěn)定性與均一性的重要指標(biāo)。指紋圖譜相似度主要是分析指紋圖譜，強(qiáng)調(diào)準(zhǔn)確的辨識(shí)而非精密的計(jì)算。宏觀上對(duì)特征進(jìn)行分析，重點(diǎn)在于辨認(rèn)圖譜整體面貌，而不是追求細(xì)枝末節(jié)[5]。

目前可查閱的關(guān)于研究指紋圖譜相似度的文獻(xiàn)較少，洪筱坤等人[6]研究指出色譜指紋圖譜的相似度需要從整體上考慮，單純引入N強(qiáng)峰、重疊率等量化數(shù)據(jù)分析圖譜間的相似程度，難以全面判斷指紋圖譜質(zhì)量。倪力軍等人[7]用相關(guān)系數(shù)和距離系數(shù)僅對(duì)紅外指紋圖譜間相似度進(jìn)行量化評(píng)價(jià)和比較，其判斷過(guò)程和結(jié)果也存在一定的主觀性。

相似度的評(píng)價(jià)方法主要包括以下三種類型：一是利用指紋圖譜間的差異性評(píng)價(jià)，如距離系數(shù)法；二是利用指紋圖譜間的相似性評(píng)價(jià)，如夾角余弦法；三是利用相似性與差異性的結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)，如改進(jìn)的Nei系數(shù)法。改進(jìn)的Nei綜合了色譜指紋圖譜的總色譜峰、保留時(shí)間、峰面積(或峰高)等多重信息，能夠比較全面地判斷指紋圖譜的綜合信息，所以又稱為綜合信息指數(shù)[8]。但是由于本試驗(yàn)采取的前處理方法為頂空固相微萃取，由于手動(dòng)操作的原因，樣品風(fēng)味成分的保留時(shí)間有所偏差，導(dǎo)致綜合信息指數(shù)波動(dòng)較大，無(wú)法準(zhǔn)確全面地判斷揚(yáng)州鹽水鵝的風(fēng)味指紋圖譜。所以，本文主要選擇前兩種評(píng)價(jià)方法綜合評(píng)價(jià)揚(yáng)州鹽水鵝指紋圖譜相似度及差異性。

2.6.1 歐氏距離[9]

歐氏距離是距離測(cè)度中使用最廣泛的一種，公式為：

式中：Xik代表第i個(gè)樣品第k個(gè)特征變量，Xrk代表共有模式均值向量第k 個(gè)特征變量(k=1，2，3……m)。歐氏距離在量上反映的是指紋圖譜間的距離和化學(xué)成分含量的差異，側(cè)重于特征變量值的大小親疏程度的相似性。但是該系數(shù)沒(méi)有考慮到各指紋峰的相關(guān)性和方差的差異性問(wèn)題，所以存在一定的局限性。

2.6.2 夾角余弦系數(shù)[10]

夾角余弦系數(shù)是指紋圖譜特征變量在變化模式上的相似性測(cè)度，源于幾何學(xué)中相似形和多維空間向量夾角的理論，其公式為：

式中：Xik代表第i個(gè)樣品第k個(gè)特征變量, Xrk代表共有模式均值向量第k個(gè)特征變量(k=1，2，3……m)。夾角余弦系數(shù)從質(zhì)上判斷樣品與標(biāo)準(zhǔn)圖譜之間的相似性，從而識(shí)別化學(xué)組成在含量比例上的相似性。

2.6.3 皮爾遜相關(guān)系數(shù)

在指紋圖譜中以相關(guān)系數(shù)測(cè)度的相似度為：

2.6.4 綜合評(píng)價(jià)

表9 1～8號(hào)揚(yáng)州鹽水鵝樣品的相似度Table 9 Similarity of Yangzhou salted goose 1～8 samples %

由表9可知，8個(gè)批次的揚(yáng)州鹽水鵝樣品的風(fēng)味指紋圖譜相似度較高。樣品的歐式距離范圍在3.88%～7.10%，夾角余弦值99.98%以上，相關(guān)系數(shù)值大于93.88%。有研究表明，歐式距離可以比較好地檢測(cè)各指紋圖譜間譜峰總面積的波動(dòng)情況[11]。而相關(guān)系數(shù)或者夾角余弦對(duì)檢測(cè)色譜峰比值的差異性靈敏度較高。以上評(píng)價(jià)指標(biāo)都可以用來(lái)評(píng)價(jià)揚(yáng)州鹽水鵝的風(fēng)味質(zhì)量。

2.6.5 待測(cè)樣品與摻兌樣品的判定

以上實(shí)驗(yàn)是根據(jù)8個(gè)批次的揚(yáng)州鹽水鵝標(biāo)準(zhǔn)品建立指紋圖譜，現(xiàn)對(duì)9號(hào)樣品分析。對(duì)待測(cè)樣品按1.3.3操作及以上3種算法計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 摻兌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 10 The results of blending experiment

由表10可知，9號(hào)樣品在不含摻兌的情況下，各項(xiàng)指標(biāo)包括歐式距離、夾角余弦和相關(guān)系數(shù)都在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度判定的標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。由此判斷該待測(cè)樣品合格。摻兌后樣品的各個(gè)相似度的變化都較為明顯，隨著摻兌含量的升高，樣品的相似度逐漸變小，說(shuō)明產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生很大波動(dòng)。綜上，指紋圖譜技術(shù)對(duì)揚(yáng)州鹽水鵝的風(fēng)味評(píng)價(jià)具有重要意義，可以有效監(jiān)控?fù)P州鹽水鵝的質(zhì)量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要探究了揚(yáng)州鹽水鵝指紋圖譜的建立及指紋圖譜相似度的計(jì)算。通過(guò)對(duì)8個(gè)批次的揚(yáng)州鹽水鵝進(jìn)行檢測(cè)分析，利用歐式距離、夾角余弦法及相關(guān)系數(shù)法等化學(xué)計(jì)量方法進(jìn)行相似度的計(jì)，算確定了以9種特征風(fēng)味物質(zhì)為基礎(chǔ)的指紋圖譜。由此構(gòu)建的指紋圖譜有較強(qiáng)的特征性及唯一性，既能起到鑒別真?zhèn)蔚男Ч?，又能起到監(jiān)控質(zhì)量的穩(wěn)定性。缺點(diǎn)是由于本試驗(yàn)的前處理方法是頂空固相微萃取，處理方法雖簡(jiǎn)單方便，但是手動(dòng)進(jìn)樣會(huì)影響風(fēng)味成分的保留時(shí)間，圖譜沒(méi)有溶劑進(jìn)樣穩(wěn)定。所以今后的研究重點(diǎn)是尋找更適合的實(shí)驗(yàn)方法，將指紋圖譜的所有特征信息有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，建立一個(gè)全面的揚(yáng)州鹽水鵝指紋圖譜，為評(píng)定揚(yáng)州鹽水鵝的風(fēng)味品質(zhì)提供新的判斷思路，改變傳統(tǒng)的依靠感官評(píng)價(jià)的單一方法。